ELISA: cum se analizează rezultatele experimentale

de Dr. Surat P, ph. d. Reviewed by Dr. Tomislav me Oktustrovi, MD, Ph. D.

ELISA, sau testul Imunosorbent legat de enzime, este un instrument utilizat pentru detectarea și cuantificarea substanțelor, cum ar fi peptidele, proteinele, anticorpii și hormonii. Aceasta implică imobilizarea unui antigen sau anticorp pe o suprafață, urmată de adăugarea unei probe care urmează să fie analizată. Detectarea depinde de o reacție specifică antigen-anticorp.

Jarun Ontakrai |

Ce trebuie făcut înainte de a rula o ELISA

un test ELISA trebuie efectuat întotdeauna în duplicate (duplicate sau triplicate) pentru a obține un număr suficient de probe pentru a calcula deviația standard și coeficientul de variație. Coeficientul de eroare trebuie menținut mai puțin de 20%. Dacă eroarea calculată este ridicată, trebuie evaluate Erorile care apar din cauza pipetării, contaminării plăcilor și reactivilor, evaporării și/sau temperaturii.

curba Standard

o curbă standard este utilizată pentru a măsura concentrația eșantionului. În primul rând, valorile absorbanței concentrațiilor standard (pg/ml) sunt reprezentate grafic. De asemenea, se face o curbă negativă care nu conține date standard de probă și este utilizată pentru a detecta și măsura zgomotul de fond. Pentru o măsurare precisă, această valoare de fundal trebuie scăzută din curba standard.

valorile de absorbție ale concentrației cunoscute pot fi reprezentate ca un martor pozitiv. Concentrația proteinei țintă este derivată prin calcularea mai întâi a absorbanței medii și apoi folosind curba standard pentru a estima concentrația.De asemenea, trebuie luați în considerare factorii de diluare

. De exemplu, dacă eșantionul a fost diluat de patru ori, atunci absorbanța trebuie înmulțită cu patru înainte de a utiliza curba standard pentru a obține concentrația.

Coeficient de variație

definiția coeficientului de variație este raportul dintre deviația standard și medie – adică deviația standard (XV)/medie (XV). Valorile mari ale coeficientului de variație indică inexactități datorate pipetării sau amestecării reactivilor între puțuri, contaminării bacteriene sau fungice, uscării puțurilor sau variațiilor de temperatură.

recuperarea Spike

valoarea obținută după efectuarea testului ELISA depinde de modul în care o proteină vizată interacționează cu anticorpii, iar această interacțiune este comparată cu o curbă proteică standard. Mai mulți factori – inclusiv anticorpi tampon, matrice și heterofili – pot afecta legarea probei, deci acest lucru trebuie luat în considerare la determinarea acurateței unui ELISA.

se poate efectua un test spike pentru a determina acuratețea rezultatelor ELISA. În acest test, o cantitate cunoscută de proteină recombinantă este adăugată sau introdusă în probă. Apoi, folosind curba standard, se măsoară cantitatea de material. Abaterile mari ale valorilor măsurate pot indica erori datorate elementelor necunoscute din test.

Linearity assay

Linearity assay este, de asemenea, utilizat pentru a determina acuratețea ELISA. În acest caz, eșantionul cu vârf este diluat în serie la 1:2, 1:4 și 1:8. Dacă se detectează concentrația eșantionului modificat și dacă rezultatele nu prezintă o modificare liniară a măsurătorilor, aceasta poate indica erori în precizia ELISA.

în unele cazuri, erorile pot fi observate la anumite concentrații și nu mai sunt observate la concentrații mai mici. În astfel de cazuri, eșantionul poate fi diluat înainte de efectuarea măsurătorilor concentrației.

depanarea

zgomotul de fond poate fi cauzat de o serie de factori, inclusiv:

• spălarea insuficientă a puțurilor
• tampoane de spălare contaminate
• prea mult reactiv de detectare
• reactivitatea încrucișată a anticorpului
• precipitarea tamponului și/sau a analitului

uneori se poate genera o curbă standard slabă. Acest lucru se poate datora erorilor în soluția standard, degradării standardului, standard este reconstituit necorespunzător sau dacă curba nu se potrivește cu scara. Având în vedere acesta din urmă, trasarea se poate face folosind diferite scale, cum ar fi Log-log sau curba logistică cu 5 parametri.

Lectură suplimentară

• conținutul testului Imunosorbent legat de enzime (ELISA)
• Aplicații ELISA
• Western Blot-Lab tehnică utilizată pentru detectarea proteinelor
• aplicații de anticorpi
• măsurarea expresiei genelor

scris de

Dr. Surat P

Dr. Surat a absolvit cu un doctorat. în biologie celulară și Mecanobiologie de la Institutul de cercetări fundamentale Tata (Mumbai, India) în 2016. Înainte de doctorat, Surat a studiat pentru un Bachelor of Science (B.Sc.) diplomă în zoologie, în timpul căreia a primit o bursă de vară a Academiei indiene de științe pentru a studia proteinele implicate în SIDA. Ea produce articole de lung metraj pe o gamă largă de subiecte, cum ar fi etica medicală, manipularea datelor, pseudoștiința și superstiția, educația și evoluția umană. Este pasionată de comunicarea științifică și scrie articole care acoperă toate domeniile științelor vieții.

Citate