Poisson distribusjon, oppkalt Etter den franske matematikeren Sim@on Denis Poisson, er sannsynligheten for forekomst av et gitt antall hendelser i en gitt (fast) tidsperiode hvis hendelsene oppstår med en konstant hastighet (kjent) og er uavhengig av forekomsten av den forrige hendelsen. Den er basert på en diskret sannsynlighetsfordeling, hvor settet av utfall er diskret eller endelig, for eksempel kaste av en mynt eller terningkast.
i sammenheng med et digitalt PCR-eksperiment er de diskrete utfallene tilstedeværelsen eller fraværet av målgenet. De tusenvis av individuelle partisjoner produsert for en digital PCR reaksjon forventes å følge En Poisson fordeling vurderer partisjonene er monodispersed og de inneholder tilsvarende volum av prøveblandingen.
hvis disse parametrene ikke er oppfylt og partisjonene viser polydispersitet, vil volumet av prøveblanding i partisjonene variere i stor grad, og de større partisjonene kan inneholde flere mål enn de mindre, noe som senker presisjonen til den digitale PCR-reaksjonen.
i dette elementet går vi deg gjennom den matematiske beregningen Av Poisson-Loven for et digitalt PCR-eksperiment.
for et digitalt PCR-eksperiment, en brønn som inneholder den partisjonerte prøven av interesse, og et målgen for å kvantifisere, må vi først definere følgende variabler:
- \(n\): totalt antall analyserbare partisjoner i brønnen
- \(p\): antall positive partisjoner for målgenet
- \(v\): volum av partisjonen (i µ), antatt å være konstant
- \(d\): fortynningsfaktor brukt til å fortynne prøven fra bestanden til brønnen
(f. eks \(d=10\) betyr at prøven er fortynnet 10 ganger)
og deretter disse ekstra:
-
\(V = N \ v\): totalt partisjonsvolum injisert i brønnen
-
\(c_{0}\) : konsentrasjon av målgener i brønnen (i kopier/µ)
-
\(C = d \ C_{0}\): konsentrasjon av målgener på lager (i kopier/µ)
-
\(\lambda = C_{0} \ v\): gjennomsnittlig antall målgener per partisjon i brønnen
fordelingen av målgenene innkapslet i brønnens partisjoner følger En Poisson-fordeling av parameter \(\lambda\):
Proba (partisjon innkapsler \(\text{$k$}\) målgener) \ (=\dfrac{\lambda^k}{k!} e^{- \lambda}\)
en partisjon er sagt:
-
«Positiv partisjon» Hvis den har innkapslet minst 1 målgen (i så fall vil vi observere en fluorescerende partisjon på sluttpunktet av forsterkningsprosessen, så det meste av usikkerheten ligger i denne» minst en » tilstand)
-
«Negativ partisjon» hvis har innkapslet 0 målgen (i så fall vil vi observere en ikke-fluorescerende partisjon på sluttpunktet av forsterkningsprosessen)
fordelingen av positive partisjoner i brønnen følger en binomial fordeling av sannsynlighet \(1 – e ^ {- \lambda}\):
- Sannsynlighet (brønn inneholder \(\tekst{$p$}\) positive partisjoner \(= {\rm C}_{N}^{p} (1 – e^{-\lambda})^p (e^{-\lambda} )^{N-p} \)
- Sannsynlighet (partisjon er negativ) \( = e^{-\lambda} \)
- Sannsynlighet (partisjon er positiv) \( = 1 – e^{-\lambda} Lambda} \)
Hvis \(N\) er stor nok:
- Proba (partisjonen er positiv) \ (=\dfrac{p}{N} \)
så formelen for den estimerte lagerkonsentrasjonen er:
\ (C = – \ dfrac{d}{v} \ ln {\venstre (1- \ dfrac{p}{N} \ høyre)} \)
Hvis du trenger å automatisk beregne estimerte konsentrasjoner av målgener, sammen med deres konfidensintervall og relativ usikkerhet, er Et online verktøy tilgjengelig: Poisson Law: Going Further. Prøv det!
For mer informasjon om usikkerhetskurvene, samt grensene for deteksjon Og kvantifisering, se elementet: Dynamiske Gjenkjenningsområder & Kvantifisering.