ELISA: näin analysoidaan kokeellisia tuloksia

tohtori Surat P, tohtori Tomislav Meštrović, MD, Ph. D.

ELISA eli entsyymi-immunologinen määritys on työkalu, jota käytetään tunnistamaan ja kvantifioimaan aineita, kuten peptidejä, proteiineja, vasta-aineita ja hormoneja. Siihen kuuluu antigeenin tai vasta-aineen immobilisointi pinnalle, minkä jälkeen siihen lisätään analysoitava näyte. Toteaminen riippuu spesifisestä antigeeni-vasta-ainereaktiosta.

Jarun Ontakrai |

Mitä tehdä ennen ELISA-testin suorittamista

ELISA-testi on aina tehtävä toistoina (kaksoiskappaleina tai kolmena kappaleena), jotta saadaan riittävä määrä näytteitä keskihajonnan ja variaatiokertoimen laskemiseksi. Virhekerroin olisi pidettävä alle 20 prosentissa. Jos laskennallinen virhe on suuri, on arvioitava pipetoinnista, levyjen ja reagenssien saastumisesta, haihtumisesta ja/tai lämpötilasta johtuvat virheet.

standardikäyrä

standardikäyrää käytetään mittaamaan näytteen pitoisuutta. Ensin piirretään standardipitoisuuksien absorbanssiarvot (pg / ml). Lisäksi tehdään negatiivinen käyrä, joka ei sisällä mitään vakionäytetietoja ja jota käytetään taustamelun havaitsemiseen ja mittaamiseen. Tarkkaa mittausta varten tämä tausta-arvo on vähennettävä standardikäyrästä.

tunnetun pitoisuuden absorbanssiarvot voidaan piirtää positiivisena kontrollina. Kohdeproteiinin pitoisuus saadaan laskemalla ensin keskimääräinen absorbanssi ja käyttämällä sitten standardikäyrää pitoisuuden arvioimiseksi.

Laimennuskertoimet on myös otettava huomioon. Jos näyte on esimerkiksi laimennettu nelinkertaiseksi, absorbanssi on kerrottava neljällä ennen kuin pitoisuus saadaan standardikäyrän avulla.

variaatiokerroin

variaatiokertoimen määritelmä on keskihajonnan ja keskiarvon suhde eli keskihajonta (σ) / keskiarvo (µ). Suuret variaatiokertoimen arvot osoittavat epätarkkuuksia, jotka johtuvat reagenssien pipetoinnista tai sekoittumisesta kaivojen välillä, bakteeri-tai sienikontaminaatiosta, kaivojen kuivumisesta tai lämpötilavaihteluista.

piikin saanto

ELISA-testin jälkeen saatu arvo riippuu siitä, miten kohdeproteiini vaikuttaa vasta-aineisiin, ja tätä yhteisvaikutusta verrataan vakioproteiinikäyrään. Useat tekijät – kuten puskuri, matriisi ja heterofiiliset vasta – aineet-voivat vaikuttaa näytteen sitoutumiseen, joten tämä on otettava huomioon ELISA-arvon tarkkuutta määritettäessä.

voidaan suorittaa piikki-määritys ELISA-tulosten tarkkuuden määrittämiseksi. Tässä määrityksessä näytteeseen lisätään tai lisätään tunnettu määrä rekombinanttiproteiinia. Sitten mitataan standardikäyrän avulla materiaalin määrä. Suuret poikkeamat mitatuissa arvoissa voivat viitata virheisiin, jotka johtuvat määrityksen tuntemattomista elementeistä.

Lineaarisuusmääritystä

Lineaarisuusmääritystä käytetään myös Elisan tarkkuuden määrittämiseen. Tässä tapauksessa ”piikkinäyte” laimennetaan sarjalimennyksellä arvoon 1:2, 1:4 ja 1:8. Jos muuttuneen näytteen pitoisuus havaitaan ja jos tuloksissa ei näy lineaarista muutosta mittauksissa, se voi kertoa virheistä Elisan tarkkuudessa.

joissakin tapauksissa virheitä voidaan havaita tietyillä pitoisuuksilla, mutta niitä ei enää havaita pienemmillä pitoisuuksilla. Tällaisissa tapauksissa näyte voidaan joutua laimentamaan ennen pitoisuusmittauksia.

Vianetsintä

taustamelu voi johtua useista tekijöistä, mm.:

• kuoppien riittämätön pesu
• kontaminoituneet pesupuskurit
• liian suuri havaitsemisreagenssi
• vasta-aineen ristireaktiivisuus
• puskurin ja/tai analyytin saostuminen

joskus saattaa syntyä huono standardikäyrä. Tämä voi johtua standardiliuoksen virheistä, standardin heikkenemisestä, standardista tehdään väärin tai jos käyrä ei sovi asteikkoon. Jälkimmäisen huomioon ottaen piirtäminen voidaan tehdä eri asteikoilla, kuten log-log tai 5 parametrilogistic curve.

lisätietoja

• Kaikki Entsyymivälitteiset Immunosorbenttimääritykset (ELISA)
• ELISA-Sovellukset
• Western Blot – Lab-tekniikka proteiinien havaitsemiseksi
• vasta-Ainehakemukset
• Geeniekspressiomittaus

kirjoittanut

tohtori Surat P

tohtori Surat valmistui filosofian tohtoriksi. Solubiologiassa ja Mekanobiologiassa Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, Intia) vuonna 2016. Ennen tohtorintutkintoaan Surat opiskeli luonnontieteiden kandidaatiksi (B.Sc.) tutkinto eläintieteessä, jonka aikana hän sai Intian tiedeakatemian Kesäapurahaa tutkiakseen aidsiin liittyviä proteiineja. Hän tuottaa artikkeleita monista eri aiheista, kuten lääketieteen etiikasta, tietojen manipuloinnista, näennäistieteestä ja taikauskosta, koulutuksesta ja ihmisen evoluutiosta. Hän suhtautuu intohimoisesti tiedeviestintään ja kirjoittaa artikkeleita, jotka kattavat kaikki biotieteiden osa-alueet.

lainaukset