PMC

HCV-RNA: n kvantifiointi.

tämän tutkimuksen tavoitteena oli kehittää yksinkertainen, reaaliaikainen QRT-PCR-määritys HCV-RNA: n kvantifiointia varten sekä seerumi-että maksanäytteistä SYBR Green I-tunnisteella sen sijaan, että käytettäisiin merkittyjä koettimia. Reaaliaikaiset QRT-PCR-määritykset suoritettiin LightCycler-laitteella (Roche), jossa oli sekä yhden kierroksen vahvistus että uusi rajoitetun syklin sisäkkäinen vahvistus. RNA-standardit transkriboitiin T7-polymeraasilla amplikoneista, jotka oli johdettu 5 ’ transloitumattomista alueen PCR-tuotteista, kloonattiin pgem-t Easyksi (Promega) ja käsiteltiin kahdesti RQ1-Dnaasilla. RNA kvantifioitiin spektrofotometrian avulla. Seeruminäytteiden yhden kierroksen kvantifiointia varten RNA litteroitiin käänteisesti edellä kuvatulla tavalla (7). Rajoitetun syklin sisäkkäisessä PCR-kvantifioinnissa RT-PCR suoritettiin yksivaiheisessa reaktiossa, jossa PCR-sykliä oli 15 (rajoitetun syklin vaihe) ja sen jälkeen reaaliaikainen QRT-PCR. HCV-kuormitukset mitattiin reaaliaikaisella PCR: llä uloimmaisten alukkeiden KY78 ja KY80 kanssa yhden kierroksen reaktioissa (21) tai ulompien alukkeiden ja sisempien alukkeiden hep21b ja hep22 kanssa rajoitetun syklin sisäkkäisissä reaktioissa (19). Reaktioseokset sisälsivät 2 µl Fast Start DNA Master SYBR Green I: tä (Roche), 4 mM MgCl2: ta, 0,5 µM: n pitoisuuden kutakin primeria ja 2 µl templaattia 20 µl: n kokonaistilavuudessa. Kun LightCycler PCR inkuboitiin 10 minuutin ajan 95°C: ssa, tehtiin 40 sykliä, joista jokainen jakso koostui 15 sekunnin jaksosta 95°C: ssa, hehkutuksesta 60°C: ssa 5 sekunnin ajan ja laajennuksesta 72°C: ssa 10 sekunnin ajan. Fluoresenssia seurattiin 530 nm: ssä, ja signaalin spesifisyys tarkastettiin sulamiskäyräanalyysillä.

synteettisen HCV-RNA: n mallina yhden kierroksen reaaliaikaisen QRT-PCR-määrityksen herkkyys oli laimennuskerrointa laskettaessa noin 103 HCV-kopiota/reaktio tai 5 × 104 kopiota/ml. Fluoresenssisignaalin havaitsemiseen tarvittavien PCR-syklien ja HCV-kopioiden lukumäärän välillä havaittiin laaja lineaarinen suhde (jopa 6, 5 × 108 kopiota/reaktio). Mittasimme seerumin viruskuorman 24 potilaalta, joilla oli kroonisesti eri HCV-genotyyppejä (1a, 1b, 2a, 2b, 2c ja 3a) (6). Kolmen potilaan viruskuorma oli alle tämän testiversion herkkyyden (5 × 104 kopiota/ml), vaikka he olivat positiivisia kvalitatiivisessa sisäkkäisessä RT-PCR-määrityksessä (19). Jäljelle jääneiden 21 potilaan viruskuorma oli 2, 8 × 105-9, 1 × 106 kopiota/ml. Määrityksen herkkyyden ja spesifisyyden lisäämiseksi otettiin käyttöön 15 syklin yksivaiheinen RT-PCR ja sen jälkeen reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR toista kierrosta varten. Synteettisellä RNA: lla modifioitu menetelmä kykeni havaitsemaan monenlaisia HCV-kopiolukuja (28: sta 2,8 × 106 HCV-kopiota/reaktio) lineaarisuuden säilyttäen. Rajoitetun kierron sisäkkäisen QRT-PCR-määrityksen herkkyys oli yli 28 kopiota/reaktio (tai 1 400 kopiota/ml), mikä oli noin 40 kertaa suurempi kuin yhden kierroksen QRT-PCR-määrityksessä. Tämän määrityksen herkkyys on suotuisaa verrattuna aiemmin raportoituihin menetelmiin, joissa käytetään reaaliaikaista kvantitointia TaqMan-tekniikalla (Roche) ja ABI Prism 7700 sequence detection system (Perkin-Elmer), joissa on raportoitu herkkyyksiä 10 kopiota/reaktio (9, 16) ja 1000 kopiota/reaktio (12). LightCycler (Roche) – ja SYBR Green I-havaintojen herkkyyden on myös raportoitu olevan 10 kopiota/reaktio (10). Tämän määritysversion validoimiseksi vahvistettiin vielä 16 HCV-positiivisen seeruminäytteen viruskuorma, joka vaihteli välillä 1 × 103-1.2 × 106 kopiota / ml (määritettynä Amplicor-Monitorimäärityksellä), osoitettiin korreloivan läheisesti sisäkkäisellä reaaliaikaisella QRT-PCR-määrityksellä (r= 0, 876, P < 0, 0001, n = 16) saatujen tulosten kanssa (kuva. (Kuva.11).

HCV replikoituu maksassa, mutta vain harvoissa tutkimuksissa on pyritty yhdistämään maksan viruskuorma kliinisiin tuloksiin, vaan on mieluummin tutkittu seerumin viruskuorman ennustavaa arvoa. Jälkimmäistä voidaan pitää sopivana korvikkeena maksan viruskuormille, jos niiden on osoitettu korreloivan, mutta kuitenkin harvat tutkimukset ovat osoittaneet tämän, eivätkä tähän mennessä raportoidut tulokset ole vakuuttavia. Siksi maksan HCV-kuormituksen mittaamiseen käytettiin rajoitetun syklin sisäkkäistä QRT-PCR-määritystä. Analyysissä käytetty maksakudoksen määrä oli 0, 8-8, 1 mg (keskiarvo = 3.88 ± 2, 1 mg), josta uutettiin 2, 1-12, 9 µg (keskiarvo = 6, 62 ± 3, 1 µg) RNA: ta. Kokonais-RNA: n tuotto oli keskimäärin 1,71 × 103 µg/g maksakudosta, mikä on sama arvo kuin aiemmassa tutkimuksessa 1,01 × 103 µg RNA: ta/g (13). Maksan viruskuorma vaihteli välillä 3, 0 × 102-1, 3 × 106 HCV-RNA-molekyyliä/µg kokonais-RNA: ta ja keskiarvo oli 2, 38 × 105 ± 3, 55 × 105 kopiota/µg RNA: ta. Maksan viruskuorman, joka mitattiin HCV-kopioiden määränä kokonais-RNA: n mikrogrammaa kohti, ja seerumin viruskuorman, joka mitattiin Amplicor-Monitorimäärityksellä, välillä on osoitettu korrelaatio, vaikka se oli heikko (R = 0, 417, n = 20) (13). Muut tutkimukset ovat osoittaneet, että seerumin HCV-RNA-pitoisuus heijastuu merkittävästi viruksen määrään maksassa ilman korrelaatiokertoimia (3, 8). Tässä raportoimme ensimmäistä kertaa tilastollisesti merkitsevän korrelaation maksan ja seerumin viruskuormitusmittausten välillä (r = 0, 689, P = 0.004, n = 15), mikä osoittaa, että viremian taso itse asiassa heijastaa viruksen määrää maksassa (Kuva. (Kuva.22).

aiemmissa tutkimuksissa maksan viruskuormitusmittaukset on ilmaistu maksakudoksen kopiomääränä milligrammaa kohti tai kokonais-RNA: n kopiomääränä mikrogrammaa kohti. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että jompikumpi yksikkö näyttää soveltuvan, koska maksakudoksen kopioiden määränä milligrammaa kohti mitatun viruskuorman ja kokonaisrna: n kopioiden määränä mikrogrammaa kohti mitatun viruskuorman välillä oli merkittävä korrelaatio (R = 0, 937, p < 0, 0001, n = 20) (Kuva. (Kuva.3).3). Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia de Molinerin ym. (3), who osoitti myös läheisen korrelaation maksan viruskuorman, ilmaistuna kopioiden lukumääränä kudosgrammaa kohti, ja kopioiden määrän mikrogrammaa kohti solun kokonaisrna: TA (r = 0, 85) (3). HCV – RNA-molekyylien määrä maksakudosgrammaa kohti oli keskimäärin 2, 1 × 108 ± 3, 71 × 108, noin 170 kertaa suurempi kuin seerumin RNA-määrä (1, 22 × 106 ± 2, 0 × 106 kopiota/ml). Tämä havainto on samanlainen kuin terrault et al. Who osoitti, että maksan HCV-RNA:n ja seerumin HCV-RNA: n suhde oli 103: 1. Sen sijaan McGuiness et al. (13) todettiin, että maksakudoksen pitoisuus oli suurempi kertoimella >104. Tämä ero saattaa liittyä siihen, että edellisessä tutkimuksessa pääasiassa pitkälle edennyttä HCV-infektiota sairastaneiden potilaiden maksan viruskuorma oli noin kahdeksankertainen (1, 83 × 106 ± 0, 75 × 106 kopiota/µg RNA: ta) verrattuna tähän tutkimukseen (2, 38 × 105 ± 3, 55 × 105 kopiota/µg RNA: ta).

yhteenvetona voidaan todeta, että reaaliaikainen QRT-PCR-määritys on herkkä, tarkka ja luotettava menetelmä HCV-kuormituksen seurantaan sekä seerumi-että maksanäytteissä.