ELISA：実験結果を分析する方法

By Dr.Surat P,Ph.D.Reviewed by Dr.Tomislav Meštrović,MD,Ph.D.

ELISA、または酵素結合免疫吸着アッセイは、ペプチド、タンパク質、抗体、およびホルモンなどの物質を検出および定量 これは、抗原または抗体を表面上に固定化し、続いて分析される試料を添加することを含む。 検出は、特異的な抗原抗体反応に依存する。

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ELISAを実行する前に何をすべきか

ELISAテストは、標準偏差と変動係数を計算するのに十分な数のサンプルを達成するために、常に反復（重複または三重）で実行する必要があります。 誤差係数は20％未満に維持する必要があります。 計算された誤差が大きい場合は、ピペッティング、プレートおよび試薬の汚染、蒸発、および/または温度に起因する誤差を評価する必要があります。

標準曲線

標準曲線は、サンプルの濃度を測定するために使用されます。 まず、標準濃度（ｐｇ／ｍｌ）の吸光度値をプロットする。 標準サンプルデータを含まず、バックグラウンドノイズを検出および測定するために使用される負の曲線も行われます。 正確な測定のためには、この背景値を標準曲線から減算する必要があります。

既知の濃度の吸光度値を陽性対照としてプロットすることができる。 標的タンパク質の濃度は、最初に平均吸光度を計算し、次に標準曲線を使用して濃度を推定することによって導出される。

希釈係数も考慮する必要があります。 例えば、サンプルが４倍に希釈されている場合、濃度を導出するために標準曲線を使用する前に、吸光度を４倍にする必要がある。

変動係数

変動係数の定義は、標準偏差と平均の比、すなわち標準偏差(μ)/平均(μ)です。 変動係数の大きな値は、ウェル間の試薬のピペットまたは混合、細菌または真菌汚染、ウェルからの乾燥、または温度変動による不正確さを示します。

スパイク回復

ELISA試験を実行した後に得られる値は、標的タンパク質が抗体とどのように相互作用するかに依存し、この相互作用は標準タンパク質曲線と比較される。 緩衝液、マトリックスおよびヘテロ親和性抗体を含むいくつかの因子は、試料の結合に影響を及ぼす可能性があるため、ELISAの精度を決定する際には

スパイクアッセイを実行して、ELISA結果の精度を決定することができます。 この試金では、組換え蛋白質の知られていた量はサンプルに加えられるか、またはスパイクされます。 次に、標準曲線を使用して、材料の量が測定される。 測定値の大きい偏差は試金の未知の要素による間違いを示すことができます。

リニアリティアッセイ

リニアリティアッセイは、ELISAの精度を決定するためにも使用されます。 この場合、「スパイクされた試料」は、１：２、１：４および１：８に連続的に希釈される。 変更されたサンプルの濃度が検出された場合、および結果が測定値の線形変化を示さない場合、それはELISAの精度の誤差を示す可能性がある。

場合によっては、特定の濃度でエラーが観察され、低濃度では観察されなくなることがあります。 そのような場合には、試料は、濃度測定が実行される前に希釈されなければならない場合がある。

トラブルシューティング

背景ノイズは、次のような多くの要因によって引き起こされる可能性があります:

• ウェルの洗浄が不十分
• 汚染された洗浄緩衝液
• 検出試薬が多すぎる
• 抗体の交差反応性
• 緩衝液および/または分析物の沈殿

時には、貧弱な標準曲線が生成されることがある。 これは、標準解の誤差、標準の劣化、標準が不適切に再構成されている、または曲線がスケールに適合しない場合に起因する可能性があります。 後者を考慮すると、プロットはlog-logや5パラメータロジスティック曲線などの異なるスケールを使用して行うことができます。

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Dr.Surat P

Dr.Suratは博士号を取得しました。 2016年、タタ基礎研究所（インド-ムンバイ）より細胞生物学とメカノバイオロジーを学ぶ。 博士号を取得する前に、スラットは科学の学士号を取得しました（B.Sc彼女はエイズに関与するタンパク質を研究するために科学の夏のフェローシップのインドアカデミーの受信者だった間に動物学の学位。） 彼女は、医療倫理、データ操作、疑似科学と迷信、教育、人間の進化など、幅広いトピックに関する特集記事を制作しています。 彼女は科学コミュニケーションについて熱情的で、生命科学のすべての区域をカバーする記事を書く。

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