HCV RNA定量を用いたヒト肝臓および血清サンプルにおけるC型肝炎ウイルスの定量。
本研究の目的は、標識プローブを使用するのではなく、SYBR Green I検出を用いて、血清および肝臓試料の両方におけるHCV RNAの定量のための簡単なリアルタイムQRT-PCRアッセイを開発することであった。 リアルタイムQRT-PCRアッセイは、シングルラウンド増幅と新規限定サイクルネスト増幅の両方を持つライトサイクラー（Roche）で行われました。 ＲＮＡ標準を、ＰＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングされた５’非翻訳領域ＰＣＲ産物から誘導されたアンプリコンからのＴ７ポリメラーゼで転写し、ＲＱ１Ｄｎａｓｅで２回処理した。 ＲＮＡを分光光度法により定量した。 血清試料の単回定量のために、ＲＮＡを、前に記載したように逆転写した（７）。 限定サイクルのネストされたＰＣＲ定量のために、ＲＴ−ＰＣＲを、１ ５サイクルのＰＣＲ（限定サイクルステップ）を伴う１ステップ反応で実施し、続いてリアルタイムＱＲＴ−ＰＣＲを実施した。 HCV負荷は、単一ラウンド反応（21）のための外部プライマー KY78とKY80または制限サイクルネスト反応（19）のための外部プライマープラス内部プライマー hep21bとhep22 反応混合物には、２μ ｌのＦａｓｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｉ（Ｒｏｃｈｅ）、４ｍ Ｍ Ｍｇｃｌ２、０． 10分間95℃でインキュベーションした後、LightCycler PCRを40サイクル、15秒で95℃、60℃で5秒、72℃で10秒の延長からなる各サイクルで行った。 蛍光を５ ３ ０ｎｍでモニターし、信号の特異性を融解曲線分析によってチェックした。
合成HCV RNAをテンプレートとして、シングルラウンドリアルタイムQRT-PCRアッセイの感度は、希釈係数を計算したときに約103HCVコピー/反応または5×104コピー/ml 蛍光シグナルを検出するために必要なPCRサイクルの数とHCVコピーの数との間に広い線形関係が観察された（最大6.5×108コピー/反応）。 我々は、慢性的にオーストラリア（1a、1b、2a、2b、2c、および3a）で流行している様々なHCV遺伝子型に感染した24人の患者の血清ウイルス負荷を測定した（6）。 彼らは定性的な社内ネストされたRT-PCRアッセイ（19）によって陽性であったが、三人の患者は、アッセイのこのバージョン（5×104コピー/ml）の感度以下のウイルス負荷 残りの21人の患者は、2.8×105から9.1×106コピー/mlの範囲のウイルス負荷を有していた。 アッセイの感度および特異性を高めるために、15サイクルのワンステップRT-PCRを、第二ラウンドのための後続のリアルタイム定量PCRとともに導入した。 合成RNAでは、修正された方法は、直線性を維持しながら、HCVコピー数（28から2.8×106HCVコピー/反応）の広い範囲を検出することができました。 限られたサイクルネストされたQRT-PCRアッセイの感度は、シングルラウンドQRT-PCRアッセイのそれよりも約40倍大きかった28コピー/反応（または1,400コピー/ml）より このアッセイの感度は、Ｔａｑｍａｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｒｏｃｈｅ）およびＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７ ７ ０ ０ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いたリアルタイム定量を用いた以前に報告された方法の感度と比較して良好であり、１ ０コピー／反応（９、１ ６）お LightCycler(Roche)およびSYBR Green I検出の感度も10コピー/反応であることが報告されている(10)。 アッセイのこのバージョンをさらに検証するために、1×103から1の範囲であった16のHCV陽性血清サンプルのウイルス負荷。２×１ ０ ６コピー／ｍｌ（Ａｍｐｌｉｃｏｒ Ｍｏｎｉｔｏｒ ａｓｓａｙで決定したように）は、ネストされたリアルタイムＱＲＴ−ＰＣＲアッセイで得られた結果と密接に相関することが示された（ｒ＝０． （図1）。11).
HCV負荷測定値とネストされたリアルタイムQRT-PCRおよびAmplicorモニターアッセイ結果との比較。 Amplicorモニターアッセイで測定され、1×103から1.2×106コピー/mlの範囲のウイルス負荷の広い範囲を持つ十六HCV陽性血清サンプルは、ネストされたリアルタイムQRT-PCRアッセイ（r=0.862、P<0。0001,n=16)。
HCVは肝臓で複製されるが、肝臓のウイルス負荷を臨床転帰に関連させようとした研究はほとんどなく、血清ウイルス負荷の予測値を調べることを好む。 後者は、肝臓のウイルス負荷が相関することが示されていれば、肝臓のウイルス負荷に適した代理と考えることができますが、これを示す研究はほ したがって、限られたサイクルネストされたQRT-PCRアッセイは、肝HCV負荷を測定するために使用されました。 分析に使用された肝臓組織の量は、0.8〜8.1mg（平均=3。88±2.1mg)を抽出し、そこから2.1から12.9μ g(平均=6.62±3.1μ g)のRNAを抽出した。 総RNAの収率は平均1.71×103μ g/gの肝臓組織であり、これは1.01×103μ gのRNA/gの以前の研究で見られた値と同様の値であった（13）。 肝ウイルス負荷は3.0×102から1.3×106HCV RNA分子/μ gの総RNAの範囲であり、平均は2.38×105±3.55×105コピー/μ gのRNAであった。 相関は、それが弱い（r=0.417、n=20）であったが、総RNAのマイクログラムあたりのHCVコピーの数の観点から測定された肝ウイルス負荷、およびAmplicorモニターアッセイで測定された血清ウイルス負荷の間に実証されている（13）。 他の研究では、血清中のＨＣＶ ＲＮＡ負荷が、相関係数を提供することなく、肝臓中のウイルスの量によって実質的に反映されることが示されている（３、８）。 ここでは、肝臓と血清ウイルス負荷測定（r=0.689、P=0）の間に統計的に有意な相関を初めて報告します。このことは、ウイルス血症のレベルが、実際には肝臓に存在するウイルスの量を反映することを示す（図１ ０Ａ、ｎ＝１ ５）。 （図1）。22).
15対の血清（ミリリットル当たりのコピー数）と肝臓（全RNAのマイクログラム当たりのコピー数）サンプルにおけるHCV RNAレベルの相関（r=0.689、P=0.004、n=15）。
以前の研究では、肝臓ウイルス負荷の測定値は、肝臓組織のミリグラムあたりのコピー数または全ＲＮＡのマイクログラムあたりのコピー数として表されて 本研究では、肝臓組織のミリグラムあたりのコピー数と、総RNAのマイクログラムあたりのコピー数として測定されたウイルス負荷との間に有意な相関があ （図1）。3).3). これらの結果はＤ Ｅ Ｍｏｌｉｎｅｒらの結果と一致した。 (3)、また、組織のグラム当たりのコピー数、および総細胞RNAのマイクログラム当たりのコピー数（r=0.85）として表される肝臓におけるウイルス量との間に密接な相関を示した人（3）。 肝臓組織のグラム当たりのHCV RNA分子の平均数は2.1×108±3.71×108であり、血清中のRNAレベル（1.22×106±2.0×106コピー/ml）よりも約170倍高かった。 この発見は、Terrault et al.の発見と類似している。 (18)、whoは、肝臓中のHCV RNAと血清中のHCV RNAの比が103:1であることを示した。 対照的に、McGuiness et al. (13)肝臓組織のレベルが>104の要因だけ大きかったことがわかりました。 この違いは、主に進行したHCV感染を有していた以前の研究の患者の肝ウイルス負荷が、本研究（2.38×105±3.55×105コピー/Μ gのRNA）に記録されたものよりも約八倍高かったという事実に関連している可能性がある。
20の肝生検におけるHCV RNAレベルの関係は、肝組織のミリグラムあたりのコピー数と全細胞RNAのマイクログラムあたりのコピー数の観点から表される(r=0.937、P<0.0001、n=20)。
結論として、リアルタイムQRT-PCRアッセイは、血清および肝臓サンプルの両方におけるHCV負荷の監視のための、敏感な正確な、信頼性の高い方法です。