O prezentare conceptuală și practică a tehnologiei ADNc microarray: implicații pentru științele de bază și clinice

Braz J Med Biol Res, octombrie 2005, volumul 38(10) 1543-1552 (recenzie)

o prezentare conceptuală și practică a tehnologiei ADNc microarray: implicații pentru științele de bază și clinice

V. De Mello-Coelho și K. L. Hess

Departamento de Histologia e Embriologia, Instituto De ci Biomecasticcias, Universidade Federal do Rio De Janeiro, Rio De Janeiro, RJ, Brazilia

rezumat
Text

corespondență și note de subsol

rezumat

ADNc microarray este o tehnologie inovatoare care facilitează analiza expresiei a mii de gene simultan. Utilizarea acestei metodologii, care evoluează rapid, necesită o combinație de expertiză din științele biologice, matematice și statistice. În această revizuire, încercăm să oferim o imagine de ansamblu a principiilor tehnologiei microarray ADNc, preocupările practice ale procesării analitice a datelor obținute, corelarea acestei metodologii cu alte metode de analiză a datelor, cum ar fi imunohistochimia în microarrays tisulare și aplicarea microarray ADNc în domenii distincte ale științelor de bază și clinice.

cuvinte cheie: Biotehnologie, ADNc microarray, expresia genelor, genomica

Introducere

genele sunt unități ereditare formate din secvențe de acid dezoxiribonucleic (ADN) organizate în cromozomi în nucleul celular. Procesul complicat de transcriere din aceste secvențe are ca rezultat generarea de acizi ribonucleici mesageri (ARNm). Aceste cod ARNm pentru proteine, care sunt compuse din aminoacizi, și să efectueze funcția desemnată a genei (1). Astfel, caracteristicile structurale și funcționale ale celulelor și țesuturilor sunt determinate de expresia simultană, selectivă și diferențială a mii de gene.

din ultimul deceniu, studiile care implică cartografierea genelor, clonarea și secvențierea au furnizat informații semnificative pentru analiza structurală a genomilor distincți (2,3). Cantitatea de informații obținute în urma acestor investigații necesită organizarea datelor obținute. Pentru a satisface această nevoie, au fost create baze de date publice pentru a stoca milioane de secvențe de gene și etichete de secvențe exprimate (Est), permițând aderarea la secvențe de gene pentru analiza asemănărilor, precum și a diferențelor dintre genomii speciilor distincte (4).

studiile structurale ale genomilor au ridicat numeroase întrebări legate de înțelegerea funcțională și reglatoare a profilurilor de expresie a genelor în tipuri de celule și țesuturi distincte din diferite organisme (3,5,6). Tehnologia microarray ADN a fost dezvoltată pentru a studia procesarea biologică complexă care implică câteva mii de gene (7,8). O astfel de tehnologie microarray utilizează fire sau sonde unice de ADN (oligomeri) care sunt imprimate pe o suprafață de sticlă folosind fotolitografie (9). O altă metodologie de microarray ADN, care este punctul central al prezentei revizuiri, este tehnologia complementară de microarray ADN (ADNc) (10). Cu aceste metodologii este posibilă 1) compararea simultană a modelului de expresie dinamică a mii de gene din celule sau țesuturi, 2) detectarea diferențelor moleculare în timpul etapelor distincte ale proceselor celulare, de exemplu diferențierea, proliferarea și inducerea apoptozei, 3) identificarea diferențelor transcripționale între condițiile non-bolnave și patologice, 4) identificarea modificărilor celulelor datorate unui răspuns la medicament și 5) identificarea biomarkerilor noi pentru utilizarea potențială în diagnosticul, prognosticul și terapia clinică a bolilor.

principiile tehnologiei ADNc microarray

o metodologie clasică utilizată pentru detectarea și cuantificarea ARNm într-o celulă dată se numește analiza Northern blot (11). Principiul principal al analizei Northern blot este hibridizarea unei sonde specifice genei radiomarcate la ARNm legat de un filtru, pentru a determina dacă acea genă este prezentă. O altă metodă utilizată pentru a detecta expresia unei gene specifice este reacția în lanț a polimerazei cu transcripție inversă (RT-PCR). RT-PCR implică utilizarea primerilor specifici genei și a transcriptazei inverse pentru a sintetiza o secvență ADNc la ARNm. ADNc este apoi amplificat prin mai multe runde de transcriere mediată de polimerază a acestui șablon ADNc (12). Există mai multe tipuri de RT-PCR, iar cea mai precisă din punct de vedere al cuantificării este metoda RT-PCR în timp real, care necesită un sistem automat capabil să detecteze fluorescența indusă în timpul reacției RT-PCR (12). În timpul RT-PCR, expresia unei anumite gene poate fi dedusă comparând-o cu genele exprimate constitutiv, cunoscute și sub numele de gene de „menaj”.

tehnologia ADNc microarray, care analizează simultan nivelurile de expresie a genelor a mii de gene, se bazează pe aceleași principii ca și cele pentru analizele Northern blot și RT-PCR (7,8). În esență, ADNc microarray este hibridizarea a mii de gene de la ADNc la țintele lor corespunzătoare pe un cip sau filtru. Cu toate acestea, provocarea actuală a acestei tehnologii este de a analiza cantitățile substanțiale de date numerice brute obținute prin achiziționarea de semnale de hibridizare (13). Analizele computaționale și biostatistice sunt necesare pentru a prelucra cu exactitate date semnificative pentru scopurile specifice ale investigației (Figura 1).

producând o matrice de microarray ADNc

recent, mai multe companii au proiectat microarray-uri ADNc axate pe sisteme specifice de profil de expresie a genelor. Aceste matrice sunt disponibile comercial de către companiile de biotehnologie, inclusiv SuperArray Bioscience Corporation și Affymetrix, pentru utilizare la prețuri accesibile. În această secțiune, încercăm să descriem pașii de bază în producerea unei matrice de microarray ADNc.

primul pas pentru producerea unei matrice de microarray ADNc este selectarea și amplificarea fragmentelor totale sau parțiale ale secvențelor ADNc care urmează să fie tipărite pe substraturi, care vor fi ulterior hibridizate cu secvențe ADNc țintă (14,15). Cele mai frecvente metode de selectare a secvențelor se bazează pe următoarele resurse: 1) bănci de date genetice, cum ar fi Unigene, dbEST și GenBank, care oferă informații despre funcția genei specifice și localizarea cromozomilor; 2) colecții de clone sau secvențe ADNc disponibile în paginile web ale întreprinderilor comerciale; 3) construcții personalizate ale bibliotecilor ADNc din celule țintă sau material tisular clonat anterior și secvențiat pentru identificarea EST. Odată selectate, fragmentele ADNc sunt amplificate prin PCR pe microplăci multiwell, purificate prin precipitații chimice și apoi examinate pentru calitate și cantitate prin electroforeză în gel. Produsele PCR sunt imprimate pe un diapozitiv sau membrană folosind o mașină robotică, microarrayer. În timpul tipăririi robotice sau depunerii ADN-ului, tuburile capilare primesc o presiune constantă și depun în serie ADN-ul pe diapozitiv sau membrană, creând astfel un design „microarray” (16). Diferite tipuri de substraturi, inclusiv lamele de sticlă și membranele de nailon sunt pre-tratate pentru a spori sarcinile lor hidrofobe, rezultând astfel o creștere a aderenței totale a secvențelor ADN la substraturi (13). Cel mai important, indexarea datelor care conține locația a mii de clone ADNc tipărite pe substraturi se realizează prin etichetarea prudentă a fiecărei microplăci folosind software conceput pentru analiza bazei de date. Această bază de date include, de asemenea, identitatea clonei (ID-ul clonei), numele genei, locația cromozomului și funcția(funcțiile) genei.

hibridizarea sondei ADNc cu matricea microarray ADN țintă

un factor crucial pentru hibridizarea cu succes a sondei ADNc la matricea microarray ADN țintă se bazează pe calitatea ARNm din celule sau țesuturi. Contaminanții ARN-ului sondei cu ADN genomic, proteine sau reziduuri de detergent pot duce la date fals pozitive/fals negative.

etichetarea sondei în timpul sintezei ADNc prin transcrierea inversă a secvențelor de ARN depinde de tipul de microarray ADNc utilizat (16). În general, atunci când analiza microarray-ului ADNc este efectuată utilizând membrane de nailon ca substrat, ARN-ul sondei este etichetat radioactiv prin încorporarea nucleotidelor dCTP-P33 în timpul procesului de transcriere inversă (7). În cazul unui microarray ADNc imprimat pe lamele de sticlă, se utilizează nucleotide radioactive (17) și coloranți fluorescenți cu rate de încorporare ridicate de eficiență, cum ar fi cianinele CY-3 dUTP și Cy-5 dUTP (8). Pentru mai multe informații despre tipurile de microarrays ADNc și procesul de hibridizare (7,8,17-20), a se vedea tabelul 1.

instrumente de analiză pentru identificarea modelelor de expresie a genelor folosind tehnologia microarray ADNc

instrumente pentru analiza cantităților masive de date generate de microarrays ADNc sunt încă în curs de dezvoltare. În prezent, anchetatorii analizează datele cDNA microarray folosind diverse programe software (21-24). Aceasta înseamnă că nu există o singură metodă de analiză a cantității masive de date obținute folosind această tehnologie. Utilizarea instrumentelor biostatistice a devenit din ce în ce mai importantă în analiza semnificației profilurilor de expresie genetică.

pentru a oferi o idee generală despre unele dintre tipurile de metode utilizate pentru a analiza datele microarray ADNc, vom descrie și discuta pașii care ar putea împiedica procesul de analiză. De cea mai mare importanță este validarea rezultatelor prin completarea mai multor experimente replicate. După achiziționarea semnalelor de hibridizare, substraturile sunt examinate vizual folosind programe de calcul. În acest caz, se ia în considerare calitatea substraturilor. De exemplu, imaginile fuzzy spot, precipitatele de vopsea sau probele cu semnale puternice de fundal sunt de obicei aruncate. Această analiză este importantă pentru a elimina artefactele, ceea ce poate duce la detectarea semnalelor fals pozitive (16). Diferiți investigatori aplică metoda de scădere de fond a semnalelor de hibridizare la semnalele nespecifice din fundal. În acest pas, în funcție de software-ul utilizat, este posibil să se scadă semnalele de fundal în următoarele două moduri: 1) prin media aritmetică sau mediana rezultată din intensitatea semnalului dintre semnalele pozitive ale petelor din substrat sau 2) prin media aritmetică sau mediana semnalului nespecific, cum ar fi intensitatea semnalului care rezultă din zona imediată din jurul fiecărui punct corespunzător unui semnal genic specific. Prin aceste două metode, media aritmetică sau valorile mediane sunt scăzute din semnalul pozitiv reprezentând o genă exprimată diferențiat (16). Achiziționarea intensității semnalului pozitiv în grilele de localizare create folosind software specific este finalizată în valori arbitrare cunoscute sub numele de algoritmi. Aceste valori pot fi accesate direct în software-ul bazei de date, care conține informații catalogate anterior ale fiecărei gene tipărite pe substrat.

datorită cantității enorme de gene analizate simultan și variabilității tuturor etapelor tehnice ale tehnicii microarray ADNc, este important să se creeze un factor de ajustare sau compensare, care se face printr-un proces de normalizare a datelor. Existența semnalelor nespecifice pe substraturi, problemele legate de cantitatea sau calitatea ARN-ului înainte de hibridizare sau variabilitatea încorporării sondei ARN-ului pot duce la afectarea normalizării probei (14,16). Pentru o interpretare semnificativă a datelor, procesul de normalizare efectuează o analiză comparativă a mediei aritmetice a algoritmilor dintr-un grup individual cu altul, ales frecvent ca control (24,25). Există mai multe tipuri de metode de normalizare și selectarea celei mai potrivite metode poate fi o provocare. Motivul pentru aceasta este că mai multe variabile experimentale împiedică adesea identificarea exactă a genelor exprimate diferențiat fără rezultate fals pozitive/fals negative care să contamineze evaluarea datelor. Suportul matematic, statistic și bioinformatic este esențial în acest stadiu în tehnologia cDNA microarray.

metodele de normalizare includ: 1) raportul logaritmic al nivelurilor de Expresie măsurate între grupuri distincte pe baza diferențelor medii, mediane, mediane sau a varianței obținute din toate semnalele pozitive situate pe substraturi; 2) analiza de regresie, care este evaluată prin coeficientul de corelație sau distanța euclidiană, și se bazează pe distribuția reprezentată de algoritmii corespunzători intensităților semnalului în probele distincte ale aceluiași grup și 3) teste statistice precum testul t sau analiza asociativă, care iau în considerare comparații multiple în pereche bazate pe pragul semnificativ de P < 0,05 și, respectiv, corecția semnificației pragului testului t (25,26). În plus, metoda de normalizare a regresiei liniare ponderate local (lowess), utilizată frecvent pentru matricele fluorescente, explică scăderea variațiilor semnalelor de hibridizare a intensității și localizarea spațială a ADNc reperat pe diapozitiv (27).

după normalizare, cea mai simplă metodă de a identifica diferențele dintre modelele de exprimare a genelor este de a utiliza diferența de raport dintre o probă și controlul său adecvat. În acest caz, se stabilește o limită arbitrară și din această valoare este posibilă selectarea genelor exprimate diferențiat folosind software-ul bazei de date. De exemplu, este posibil să se stabilească un prag de 2 ori pentru a identifica genele cu modificări semnificative ale nivelului de Expresie. În timpul acestui proces, genele din acest interval vor fi selectate și organizate în tabele situate în baza de date. Genele care îndeplinesc criteriile de selecție pot fi vizualizate din baze de date folosind software care prezintă hărți autoorganizate (28,29). Mai mult, aceste modificări ale profilurilor de expresie genetică între grupuri distincte pot fi vizualizate în dendrograme pe baza analizei ierarhice de grupare (25,29,30). În acest caz, genele care sunt reglate în jos sunt în general prezentate în verde și genele reglate în sus sunt în general prezentate în roșu. Deoarece diferența de reglare a genelor este mai intensă, la fel este și culoarea respectivă. Programele Software pentru analiza datelor cDNA microarray sunt disponibile prin Internet.

este important de menționat că analiza profilurilor de expresie genetică dobândite prin tehnologia microarray ADNc implică mii de gene analizate concomitent. Înainte de a efectua studii fiziologice ale genelor selectate, rezultatele microarray-ului ADNc trebuie confirmate la nivel de ARN prin analiza Northern blot sau RT-PCR în timp real (14). Acest lucru elimină posibilitatea rezultatelor fals pozitive ale microarray-ului ADNc datorate hibridizării încrucișate între gene din aceeași familie de gene. Confirmarea suplimentară este, de asemenea, foarte recomandată la nivelul proteinelor, cum ar fi prin analiza Western blot, citometria în flux sau imunohistochimia. În acest context, în prezent este posibilă evaluarea genelor la nivel proteic folosind teste de microarray tisular (31-33). Testul microarray tisular este o metodă care permite evaluarea a până la o mie de țesuturi simultan folosind un marker specific. Practic, biopsiile cu miez mic de 1 mm sau mai puțin sunt izolate de blocurile individuale de țesut încorporate în parafină cu un dispozitiv metalic special sau ac și plasate într-un alt bloc de parafină într-o manieră aranjată. Avantajele acestei tehnici sunt: 1) economia și conservarea specimenelor de țesut originale obținute pentru biopsie pentru a construi matricea; 2) pentru a evita problemele tehnice, deoarece matricea este construită într-o singură lamelă de sticlă, facilitând astfel procesele tehnice de spălare și colorare și 3) viteza de a efectua analize in situ simultan în mai multe probe de țesut simultan. Din punct de vedere clinic, este o tehnică puternică de utilizat în comun cu analiza microarray-ului ADNc pentru a identifica biomarkeri noi pentru utilizare potențială ca instrumente de diagnostic, prognostic și terapeutic împotriva condițiilor patologice (31,32).

tehnologia ADNc microarray: aplicații și perspective

în ceea ce privește aplicarea, tehnologia ADNc microarray conduce la identificarea genelor specifice și permite cercetătorilor să compare profilurile expresiei genelor în condiții normale față de cele patologice în diferite organisme. În știința de bază, microarray-ul ADNc a fost utilizat pentru a identifica rolul mai multor gene implicate în procesele celulare, cum ar fi diferențierea celulară, prin compararea modelelor de expresie genetică între culturile celulare normale și transfectate, de exemplu (34). Multe grupuri de cercetare au folosit tehnologia ADNc microarray pentru a studia tipuri distincte de cancer, precum și patogeneza bolilor infecțioase (35-40). În acest caz, identificarea genelor noi sau a modificărilor modelelor de expresie a genelor în țesuturi de la starea non-bolnavă la starea bolnavă a contribuit la o mai bună înțelegere a mecanismelor moleculare care reglează debutul și progresul bolilor. În plus, ADNc microarray a fost considerată o metodologie foarte interesantă în industria farmaceutică. În acest context, analiza profilului expresiei genelor la scară largă a celulelor supuse unor teste medicamentoase distincte ar putea fi relevantă pentru clasificarea agenților potențiali de uz terapeutic (41). Câteva exemple de aplicare a metodologiei ADNc microarray în științele de bază și clinice (34-48) sunt descrise în tabelul 2.

analiza ADNc microarray este o metodologie costisitoare, dar abundența rezultatelor generate de această tehnologie este un câștig incontestabil. Odată ce o unitate centrală de cercetare este organizată pentru dezvoltarea acestei metodologii, diverși cercetători se pot bucura de avantajul utilizării substraturilor microarray cDNA tipărite anterior pentru a investiga genele exprimate diferențiat atât în zonele biologice, cât și în cele clinice. Pentru organizarea unităților de microarray ADNc, trebuie luată în considerare interacțiunea multidisciplinară dintre arenele matematice și biologice. Un model schematic ipotetic simplu care demonstrează infrastructura unei unități de microarray ADNc este prezentat în Figura 2.

în cele din urmă, băncile centralizate care conțin date ale profilurilor de expresie genetică analizate prin tehnologia cDNA microarray au fost create și sunt disponibile pentru inspecție prin Internet (49,50). În acest fel, diferite grupuri din întreaga lume vor putea compara datele profilurilor genetice selectate cu altele depozitate în bănci de date moleculare, cum ar fi Gene Expression Omnibus sau array Express, proiectate de Institutul European de Bioinformatică (51).

o problemă care a restricționat o interacțiune benefică între diferite grupuri de cercetare care utilizează tehnologia cDNA microarray este lipsa standardelor pentru prezentarea și schimbul de rezultate. Pentru a compensa această situație dificilă, au fost create informațiile minime pentru adnotarea unui Experiment Microarray (MIAME) (52). Liniile directoare care conduc la standardizarea experimentelor de microarray ADNc au fost propuse de Societatea de date privind expresia genelor Micro-matrice (MGED). MIAME este compus practic din șase secțiuni: 1) proiectare experimentală; 2) proiectare matrice; 3) probele utilizate, preparate extract, și hibridizare; 4) procedurile și parametrii de hibridizare; 5) imagine, cuantificare, și măsurarea parametrilor, și 6) tipuri, valori și specificații pentru controalele de normalizare. MIAME a devenit o cerință de a publica rezultatele cDNA microarray în multe reviste științifice. În plus, grupuri distincte, inclusiv MGED, Rosetta, Agilent și Affymetrix, au lucrat împreună folosind bioinformatică pentru a proiecta expresia genelor microarray (MAGE), care este o platformă comună de structură flexibilă care permite comunicarea între diferite grupuri de cercetare folosind tehnologia cDNA microarray. MAGE este compus din următoarele: 1) MAGE-ON (object model), un model de date centric care utilizează un limbaj de modelare unificat și implementează cerințele MIAME; 2) MAGE-ML (limbaj de marcare), care documentează traducerea de la MAGE-OM la un format de date bazat pe XML și 3) MAGE-SLK, un software accesibil liber care definește interfața programatorilor de aplicații la MAGE-OM, permițând astfel exportul de date către MAGE-ML și rezultând ulterior stocarea datelor într-o bază de date relațională (53).

recent, nanotehnologia a fost implementată pe scară largă în diverse domenii, cum ar fi aplicațiile industriale, farmaceutice și guvernamentale, pentru a îmbunătăți progresele științifice moderne. Datorită caracteristicilor fizice și chimice unice ale nanoparticulelor, aceste materiale au capacitatea de a spori dispozitivele senzoriale, aditivii de propulsie, tehnicile de remodelare a țesuturilor și mecanismele de direcționare a medicamentelor. În plus, nanotehnologia a fost utilizată pentru a îmbunătăți competența microarray (54) și pentru a ajuta la dezvoltarea nanoarrays de proteine (55). În cadrul laboratorului, oamenii de știință încep acum să investigheze potențialul impact pozitiv/negativ pe care nanoparticulele îl au asupra inducerii/inhibării genelor din celule prin utilizarea tehnicii microarray (56). În cele din urmă, combinația nanotehnologiei cu tehnologia microarray a avansat chiar și cunoștințele actuale ale genelor reglementate diferențiat în timpul proceselor de boală (57,58).

împreună, aceste instrumente pot contribui la înțelegerea funcțiilor genice noi în diverse genomi și a modului în care acestea se corelează cu patogeneza bolii la om. Dezvoltarea și aplicarea tehnologiei ADNc microarray au adus multe progrese în descoperirea medicamentelor, diagnosticarea cercetării și terapia genică potențială destinată tratamentului diferitelor boli. Această tehnologie fundamentală ajută cercetătorii să înțeleagă mecanismele moleculare implicate în procese biologice multiple și diverse.

9. Sengupta R & Tompa M (2002). Controlul calității în fabricarea matricelor oligo: o abordare de proiectare combinatorie. Jurnalul de Biologie computațională, 9: 1-22.

11. Alwine JC, Kemp DJ & Stark GR (1977). Metodă de detectare a ARN-urilor specifice în gelurile de agaroză prin transfer la hârtie diazobenziloximetil și hibridizare cu sonde ADN. Lucrările Academiei Naționale de științe, SUA, 74: 5350-5354.

12. Bustin A (2000). Cuantificarea absolută a ARNm utilizând teste de reacție în lanț a polimerazei cu transcripție inversă în timp real. Jurnalul de Endocrinologie moleculară, 25: 169-193.

17. Whitney LW & Becker KG (2001). Sonde Radioactive 33-P în hibridizare la microarrays de ADNc din sticlă folosind țesuturi neuronale. Jurnalul metodelor de neuroștiință, 106: 9-13.

19. Shalon D, Smith SJ & Brown PO (1996). Un sistem de microarray ADN pentru analiza probelor complexe de ADN folosind două culori fluorescente sonda hibridizare. Cercetarea Genomului, 6: 639-645.

20. Bertucci F, Bernard K, Loriod B și colab. (1999). Probleme de sensibilitate în măsurătorile de expresie bazate pe matrice ADN și performanța microarrays din nailon pentru probe mici. Genetica Moleculară Umană, 8: 1715-1722.

22. Kerr MK & Churchill GA (2001). Analiza clusterului Bootstrapping: evaluarea fiabilității concluziilor din experimentele microarray. Lucrările Academiei Naționale de științe, SUA, 98: 8961-8965.

23. Planeta PJ, Desalle R, Sidall M și colab. (2001). Analiza sistematică a datelor microarray ADN: ordonarea și interpretarea modelelor de exprimare a genelor. Cercetarea Genomului, 11: 1149-1155.

24. Tanaka TS, Jaradat SA, Lim MK și colab. (2000). Profilarea expresiei la nivel de genom a placentei și a embrionului la mijlocul gestației folosind un microarray de ADNc de dezvoltare de 15.000 de șoareci. Lucrările Academiei Naționale de științe, SUA, 97: 9127-9132.

25. Quackenbush J (2001). Analiza computațională a datelor microarray. Genetica Naturii, 2: 418-427.

27. Yang YH, Dudoit S, Luu P și colab. (2002). Normalizare pentru datele microarray ADNc: o metodă compozită robustă care abordează variația sistematică a diapozitivelor unice și multiple. Cercetarea acizilor nucleici, 30: e15.

28. Tamayo P, Slonim D, Mesirov J și colab. (1999). Interpretarea modelelor de exprimare a genelor cu hărți autoorganizate: metode și aplicații la diferențierea hematopoietică. Lucrările Academiei Naționale de științe, SUA, 96: 2907-2912.

30. Eisen MB, Spellman PT, Brown PO și colab. (1998). Analiza Cluster și afișarea modelelor de Expresie la nivel de genom. Lucrările Academiei Naționale de științe, SUA, 95: 14863-14868.

31. Braunschweig T, Chung JY & Hewitt SM (2004). Perspective în microarrays tisulare. Chimie combinatorie și Screening cu randament ridicat, 7: 575-585.

34. Tseng YH, Butte AJ, Kokkotou E și colab. (2005). Predicția diferențierii preadipocitelor prin expresia genelor relevă rolul substraturilor receptorilor de insulină și necdin. Biologia Celulară A Naturii, 7: 601-611.

36. Staudt LM (2001). Fiziologia expresiei genelor și fiziopatologia sistemului imunitar. Tendințe în Imunologie, 22: 35-40.

37. Berns A (2000). Expresia genelor în diagnostic. Natură, 403: 491-492.

38. Sawiris GP, Sherman-Baust CA, Becker KG și colab. (2002). Dezvoltarea unui tablou ADNc foarte specializat pentru studiul și diagnosticul cancerului ovarian epitelial. Cercetarea Cancerului, 62: 2923-2928.

39. Khan J, Wei JS, Ringner M și colab. (2001). Clasificarea și predicția diagnosticului cancerelor utilizând profilarea expresiei genelor și rețelele neuronale artificiale. Medicina Naturii, 7: 673-679.

40. Chang JC, Hilsenbeck SG & Fuqua SA (2005). Abordări genomice în managementul și tratamentul cancerului de sân. Jurnalul britanic de Cancer, 92: 618-624.

41. Lovett RA (2000). Toxicogenomică. Toxicologii se pregătesc pentru Revoluția genomică. Știință, 289: 536-537.

42. Flores-Morales A, Stahlberg N, Tollet-Egnell P și colab. (2001). Analiza Microarray a efectelor in vivo ale hipofizectomiei și tratamentului cu hormon de creștere asupra expresiei genelor la șobolan. Endocrinologie, 142: 3163-3176.

43. Liu K, Li Y, Prabhu V și colab. (2001). Augmentarea în expresia genelor induse de activare diferențiază memoria de celulele T CD4 + naive și este un mecanism molecular pentru răspunsul celular îmbunătățit al celulelor T CD4+ de memorie. Jurnalul de Imunologie, 166: 7335-7344.

44. Hess K, Yang Y, Golech S și colab. (2004). Evaluarea cinetică a modificărilor generale ale expresiei genelor în timpul activării celulelor T CD4+ naive umane. Imunologie Internațională, 16: 1711-1721.

46. Hacia JG, Fan JB, Ryder O și colab. (1999). Determinarea alelelor ancestrale pentru polimorfismele umane cu un singur nucleotid folosind matrice oligonucleotidice de înaltă densitate. Genetica Naturii, 22: 164-167.

49. Miles M (2001). Microarray: pierdut într-o furtună de date? Neuroștiința Naturii, 2: 441-443.

50. Becker KG (2001). Schimbul de date ADNc microarray. Neuroștiința Naturii, 2: 438-440.

54. Wang X, Jiang N, Feng X și colab. (2003). O abordare nouă pentru procesarea microarray de înaltă calitate folosind tehnologia de vizualizare a matricei de coloranți. Tranzacții IEEE pe Nanobioscience, 2: 193-201.

56. Berry CC, Charles S, Wells S și colab. (2004). Influența transferului nanoparticulelor magnetice stabilizate asupra fibroblastelor dermice umane în cultură. Jurnalul Internațional de farmacie, 269: 211-225.

57. Crnic I & Christofori G (2004). Tehnologii noi și progrese recente în cercetarea metastazelor. Jurnalul Internațional de Biologie a dezvoltării, 48: 573-581.

corespondență și note de subsol