Concettuale e pratica sulle cDNA microarray technology: implicazioni per le scienze di base e cliniche

Braz J Med Biol Res, ottobre 2005, Volume 38(10) 1543-1552 (Recensione)

concettuale e pratica sulle cDNA microarray technology: implicazioni per le scienze di base e cliniche

V. de Mello-Coelho e K. L. Hess

Departamento de Histologia e Embriologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brasile

Abstract
Testo

Corrispondenza e Note a piè di pagina

Abstract

cDNA microarray è una tecnologia innovativa che facilita l’analisi di espressione di migliaia di geni contemporaneamente. L’utilizzo di questa metodologia, che è in rapida evoluzione, richiede una combinazione di competenze provenienti dalle scienze biologiche, matematiche e statistiche. In questa recensione, cerchiamo di fornire una panoramica dei principi della tecnologia cDNA microarray, le preoccupazioni pratiche dell’elaborazione analitica dei dati ottenuti, la correlazione di questa metodologia con altri metodi di analisi dei dati come l’immunoistochimica nei microarray tissutali e l’applicazione di cDNA microarray in aree distinte delle scienze di base e cliniche.

Parole chiave: Biotecnologia, cDNA microarray, espressione genica, Genomica

Introduzione

I geni sono unità ereditarie formate da sequenze di acido desossiribonucleico (DNA) organizzate nei cromosomi nel nucleo cellulare. L’intricato processo di trascrizione da queste sequenze determina la generazione di acidi ribonucleici messaggeri (mRNA). Questi mRNA codificano per le proteine, che sono composte da amminoacidi e svolgono la funzione designata del gene (1). Pertanto, le caratteristiche strutturali e funzionali di cellule e tessuti sono determinate dall’espressione simultanea, selettiva e differenziale di migliaia di geni.

Dall’ultimo decennio, studi che coinvolgono la mappatura genica, la clonazione e il sequenziamento hanno fornito informazioni significative per l’analisi strutturale di genomi distinti (2,3). La quantità di informazioni ottenute da queste indagini richiede l’organizzazione dei dati acquisiti. Per soddisfare questa esigenza, sono state create banche dati pubbliche per memorizzare milioni di sequenze geniche e tag di sequenze espresse (EST), consentendo l’adesione a sequenze geniche per l’analisi delle somiglianze e delle differenze tra genomi di specie distinte (4).

Gli studi strutturali dei genomi hanno sollevato numerose domande relative alla comprensione funzionale e normativa dei profili di espressione genica in tipi di cellule e tessuti distinti da vari organismi (3,5,6). La tecnologia DNA microarray è stata sviluppata per studiare il complesso processo biologico che coinvolge diverse migliaia di geni (7,8). Una di queste tecnologie di microarray utilizza singoli filamenti di DNA o sonde (oligomeri) che vengono impressi su una superficie di vetro mediante fotolitografia (9). Un’altra metodologia DNA microarray, che è al centro della presente revisione, è complementare DNA (cDNA) microarray technology (10). Con queste metodologie è possibile 1) per confrontare simultaneamente la dinamica pattern di espressione di migliaia di geni in cellule o tessuti, 2) per rilevare le differenze molecolari durante fasi distinte di processi cellulari, ad esempio, la differenziazione, la proliferazione e l’induzione di apoptosi, 3) per identificare le differenze di transcriptional tra non-malati e condizioni patologiche, 4) per identificare i cambiamenti nelle cellule a causa di una risposta di droga e 5) per identificare nuovi biomarcatori per un potenziale utilizzo nella diagnosi, prognosi e terapia clinica di malattie.

I principi della tecnologia cDNA microarray

Una metodologia classica utilizzata per il rilevamento e la quantificazione di mRNA in una data cella è chiamata analisi Northern blot (11). Il principio principale dell’analisi Northern blot è l’ibridazione di una sonda gene-specifica radiomarcata con mRNA legato a un filtro, al fine di determinare se quel gene è presente. Un altro metodo utilizzato per rilevare l’espressione di un gene specifico è la reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa (RT-PCR). RT-PCR prevede l’uso di primer gene-specifici e trascrittasi inversa per sintetizzare una sequenza di cDNA all’mRNA. Il cDNA viene quindi amplificato da più cicli di trascrizione mediata dalla polimerasi di questo modello cDNA (12). Esistono diversi tipi di RT-PCR e il più preciso in termini di quantificazione è il metodo RT-PCR in tempo reale, che richiede un sistema automatizzato in grado di rilevare la fluorescenza indotta durante la reazione RT-PCR (12). Durante la RT-PCR, l’espressione di un determinato gene può essere dedotta confrontandola con geni espressi costitutivamente, noti anche come geni “housekeeping”.

La tecnologia cDNA microarray, che analizza simultaneamente i livelli di espressione genica di migliaia di geni, si basa sugli stessi principi di quelli delle analisi Northern blot e RT-PCR (7,8). Essenzialmente, cDNA microarray è l’ibridazione di migliaia di geni da cDNA ai loro bersagli corrispondenti su un chip o filtro. Tuttavia, la sfida attuale di questa tecnologia consiste nell’analizzare le notevoli quantità di dati numerici grezzi ottenuti attraverso l’acquisizione di segnali di ibridazione (13). Le analisi computazionali e biostatistiche sono necessarie per elaborare accuratamente dati significativi per gli scopi specifici dell’indagine (Figura 1).

Produrre una matrice di microarray cDNA

Recentemente, diverse aziende hanno progettato cDNA microarray focalizzati su specifici sistemi di profilo di espressione genica. Queste matrici sono disponibili in commercio da aziende biotecnologiche, tra cui SuperArray Bioscience Corporation e Affymetrix, per l’uso a prezzi accessibili. In questa sezione, cerchiamo di descrivere i passaggi di base nella produzione di una matrice microarray cDNA.

Il primo passo per la produzione di una matrice di microarray cDNA è la selezione e l’amplificazione di frammenti totali o parziali di sequenze di cDNA da stampare su substrati, che saranno successivamente ibridati con sequenze di cDNA target (14,15). I metodi più comuni per la selezione delle sequenze si basano sulle seguenti risorse: 1) banche dati geniche come Unigene, dbEST e GenBank, che forniscono informazioni sulla funzione del gene specifico e sulla localizzazione dei cromosomi; 2) collezioni di cloni o sequenze di cDNA disponibili nelle homepage di siti Web di imprese commerciali; 3) costruzioni su misura di librerie di cDNA da materiale cellulare o tissutale target precedentemente clonato e sequenziato per l’identificazione EST. Una volta selezionati, i frammenti di cDNA vengono amplificati mediante PCR su micropiastre multiwell, purificati per precipitazione chimica e quindi esaminati per qualità e quantità mediante elettroforesi su gel. I prodotti PCR vengono stampati su una diapositiva o una membrana utilizzando una macchina robotica, la microarrayer. Durante la stampa robotica, o deposizione, del DNA, i tubi capillari ricevono una pressione costante e depositano in serie il DNA sul vetrino o sulla membrana, creando così un design “microarray” (16). Vari tipi di substrati, inclusi vetrini e membrane in nylon, sono pretrattati per aumentare le loro cariche idrofobiche, determinando così un aumento dell’aderenza totale delle sequenze di DNA ai substrati (13). Soprattutto, l’indicizzazione dei dati che contiene la posizione di migliaia di cloni cDNA stampati sui substrati viene eseguita mediante un’etichettatura prudente di ciascuna micropiastra utilizzando un software progettato per l’analisi del database. Questo database include anche l’identità del clone(clone ID), il nome del gene, la posizione del cromosoma e la funzione genica (s).

Ibridazione della sonda cDNA con la matrice target DNA microarray

Un fattore cruciale per il successo dell’ibridazione della sonda cDNA con la matrice target DNA microarray si basa sulla qualità dell’mRNA da cellule o tessuti. Contaminanti dell’RNA della sonda con DNA genomico, proteine o residui di detersivo possono causare dati falsi positivi / falsi negativi.

L’etichettatura della sonda durante la sintesi di cDNA mediante trascrizione inversa di sequenze di RNA dipende dal tipo di microarray cDNA utilizzato (16). In generale, quando l’analisi del microarray cDNA viene eseguita utilizzando membrane di nylon come substrato, l’RNA della sonda viene etichettato radioattivamente mediante incorporazione di nucleotidi dCTP-P33 durante il processo di trascrizione inversa (7). Nel caso di un microarray cDNA stampato su vetrini, vengono utilizzati nucleotidi radioattivi (17) e coloranti fluorescenti ad alta efficienza di incorporazione, come le cianine Cy-3 dUTP e Cy-5 dUTP (8). Per ulteriori informazioni sui tipi di microarray cDNA e sul processo di ibridazione (7,8,17-20), vedere Tabella 1.

Strumenti di analisi per l’identificazione di modelli di espressione genica utilizzando la tecnologia cDNA microarray

Strumenti per l’analisi delle enormi quantità di dati generati dai microarray cDNA sono ancora in fase di sviluppo. Attualmente, gli investigatori analizzano i dati cDNA microarray utilizzando diversi programmi software (21-24). Ciò significa che non esiste un unico metodo per analizzare l’enorme quantità di dati ottenuti utilizzando questa tecnologia. L’uso di strumenti biostatistici è diventato sempre più importante nell’analisi del significato dei profili di espressione genica.

Per fornire un’idea generale su alcuni dei tipi di metodi utilizzati per analizzare i dati cDNA microarray, descriveremo e discuteremo i passaggi che potrebbero ostacolare il processo di analisi. Della massima importanza è la convalida dei risultati completando più esperimenti replicati. Dopo l’acquisizione dei segnali di ibridazione, i substrati vengono esaminati visivamente utilizzando programmi computazionali. In questo caso, viene considerata la qualità dei substrati. Ad esempio, immagini spot sfocate, precipitati di tintura o campioni con forti segnali di sfondo vengono solitamente scartati. Questa analisi è importante per eliminare gli artefatti, che possono portare al rilevamento di segnali falsi positivi (16). Vari ricercatori applicano il metodo di sottrazione di fondo dei segnali di ibridazione ai segnali non specifici in background. In questa fase, a seconda del software utilizzato, è possibile sottrarre i segnali di sfondo nei seguenti due modi: 1) dalla media aritmetica o mediana risultante dall’intensità del segnale tra i segnali positivi dei punti nel substrato, o 2) dalla media aritmetica o dalla mediana del segnale non specifico, come l’intensità del segnale risultante dall’area immediata attorno a ciascun punto corrispondente a un segnale genetico specifico. Con questi due metodi, la media aritmetica o i valori mediani vengono sottratti dal segnale positivo che rappresenta un gene espresso in modo differenziale (16). L’acquisizione dell’intensità del segnale positivo in griglie di localizzazione create utilizzando software specifici viene completata in valori arbitrari noti come algoritmi. Questi valori sono accessibili direttamente nel software del database, che contiene informazioni precedentemente catalogate di ciascun gene stampato sul substrato.

A causa dell’enorme quantità di geni analizzati simultaneamente e della variabilità in tutte le fasi tecniche della tecnica cDNA microarray, è importante creare un fattore di aggiustamento o compensazione, che viene fatto attraverso un processo di normalizzazione dei dati. L’esistenza di segnali non specifici sui substrati, problemi legati alla quantità o alla qualità dell’RNA prima dell’ibridazione o variabilità nell’incorporazione della sonda dell’RNA possono portare alla compromissione della normalizzazione del campione (14,16). Per un’ulteriore interpretazione significativa dei dati, il processo di normalizzazione esegue un’analisi comparativa della media aritmetica degli algoritmi da un singolo gruppo con un altro, spesso scelto come controllo (24,25). Esistono diversi tipi di metodi di normalizzazione e selezionare il metodo più appropriato può essere una sfida. La ragione di ciò è che più variabili sperimentali spesso impediscono l’identificazione accurata di geni espressi in modo differenziato senza risultati falsi positivi/falsi negativi che contaminano la valutazione dei dati. Il supporto matematico, statistico e bioinformatico è fondamentale in questa fase della tecnologia cDNA microarray.

I metodi di normalizzazione includono: 1) il rapporto logaritmico dei livelli di espressione misurati tra gruppi distinti in base alla media, alla mediana, alle differenze mediane o alla varianza ottenuta da tutti i segnali positivi situati sui substrati; 2) analisi di regressione, che è valutata con il coefficiente di correlazione o Euclideo distanza, e si basa sulla distribuzione rappresentata da algoritmi corrispondente all’intensità di segnale in distinti campioni di uno stesso gruppo, e 3) test statistici come il t-test o analisi associativa, che prendono in considerazione più associati confronti sulla base di una significativa soglia di P < 0.05 e t-test di soglia significato di correzione, rispettivamente (25,26). Inoltre, il metodo di normalizzazione della regressione lineare ponderata localmente (lowess), usato frequentemente per gli array fluorescenti, rappresenta le variazioni decrescenti dei segnali di ibridazione dell’intensità e la posizione spaziale del cDNA maculato sulla diapositiva (27).

Dopo la normalizzazione, il metodo più semplice per identificare le differenze tra i modelli di espressione genica consiste nell’utilizzare la differenza di rapporto tra un campione e il suo controllo appropriato. In questo caso, viene stabilito un limite arbitrario e da questo valore è possibile selezionare i geni espressi in modo differenziato utilizzando il software del database. Ad esempio, è possibile stabilire una soglia di 2 volte per identificare i geni con cambiamenti significativi nel livello di espressione. Durante questo processo, i geni all’interno di questo intervallo saranno selezionati e organizzati in tabelle situate nel database. I geni che soddisfano i criteri di selezione possono essere visualizzati da database utilizzando un software che mostra mappe auto-organizzanti (28,29). Inoltre, questi cambiamenti nei profili di espressione genica tra gruppi distinti possono essere visualizzati in dendrogrammi basati su analisi di clustering gerarchico (25,29,30). In questo caso, i geni che sono regolati in basso sono generalmente mostrati in verde e i geni regolati in alto sono generalmente mostrati in rosso. Poiché la differenza di regolazione genica è più intensa, lo è anche il suo rispettivo colore. Programmi software per analizzare i dati cDNA microarray sono disponibili via Internet.

È importante notare che l’analisi dei profili di espressione genica acquisiti dalla tecnologia cDNA microarray coinvolge migliaia di geni analizzati contemporaneamente. Prima di eseguire studi fisiologici su geni selezionati, i risultati del microarray cDNA devono essere confermati a livello di RNA mediante analisi Northern blot o RT-PCR in tempo reale (14). Questo elimina la possibilità di risultati falsi positivi cDNA microarray a causa di ibridazione incrociata tra geni all’interno della stessa famiglia di geni. Un’ulteriore conferma è anche altamente raccomandata a livello proteico, come l’analisi Western blot, la citometria a flusso o l’immunoistochimica. In questo contesto, è attualmente possibile valutare i geni a livello proteico utilizzando saggi di microarray tissutale (31-33). Tissue microarray assay è un metodo che consente la valutazione di un massimo di mille tessuti contemporaneamente utilizzando un marker specifico. Fondamentalmente, piccole biopsie di nucleo di 1 mm o meno sono isolate da singoli blocchi di tessuto incorporati in paraffina con uno speciale dispositivo metallico o ago e collocate in un altro blocco di paraffina in modo allineato. I vantaggi di questa tecnica sono: 1) l’economia e la conservazione dei campioni di tessuto originali ottenuti per la biopsia per costruire l’array; 2) per evitare problemi tecnici poiché l’array è costruito in un unico vetrino, facilitando così i processi tecnici di lavaggio e colorazione, e 3) la velocità di eseguire analisi in situ simultaneamente in più campioni di tessuto contemporaneamente. Clinicamente, è una tecnica potente da utilizzare congiuntamente con l’analisi microarray cDNA per identificare nuovi biomarcatori per un potenziale utilizzo come strumenti diagnostici, prognostici e terapeutici contro condizioni patologiche (31,32).

cDNA microarray tecnologia: applicazioni e prospettive

In termini di applicazione, la tecnologia cDNA microarray porta all’identificazione di geni specifici e consente ai ricercatori di confrontare i profili di espressione genica in condizioni normali rispetto a quelle patologiche in vari organismi. Nella scienza di base, cDNA microarray è stato utilizzato per identificare il ruolo di diversi geni coinvolti nei processi cellulari, come la differenziazione cellulare, attraverso il confronto dei modelli di espressione genica tra colture cellulari normali e trasfette, ad esempio (34). Molti gruppi di ricerca hanno utilizzato la tecnologia cDNA microarray per studiare tipi distinti di tumori e la patogenesi delle malattie infettive (35-40). In questo caso, l’identificazione di nuovi geni o cambiamenti nei modelli di espressione genica nei tessuti dallo stato non malato a quello malato ha contribuito a comprendere meglio i meccanismi molecolari che regolano l’insorgenza e il progresso delle malattie. Inoltre, cDNA microarray è stato considerato una metodologia molto interessante nell’industria farmaceutica. In questo contesto, l’analisi del profilo di espressione genica su larga scala di cellule sottoposte a test antidroga distinti potrebbe essere rilevante per classificare potenziali agenti per uso terapeutico (41). Diversi esempi di applicazione della metodologia cDNA microarray nelle scienze di base e cliniche (34-48) sono descritti nella Tabella 2.

L’analisi cDNA microarray è una metodologia costosa, ma l’abbondanza di risultati generati da questa tecnologia è un guadagno indiscutibile. Una volta organizzata un’unità centrale di ricerca per lo sviluppo di questa metodologia, vari ricercatori possono godere del vantaggio di utilizzare substrati di microarray cDNA precedentemente stampati per studiare geni espressi in modo differenziato in entrambe le aree biologiche e cliniche. Per l’organizzazione delle unità microarray cDNA, deve essere considerata l’interazione multidisciplinare tra arene matematiche e biologiche. Un semplice modello schematico ipotetico che dimostra l’infrastruttura di un’unità microarray cDNA è mostrato in Figura 2.

Infine, sono state create banche centralizzate contenenti dati dei profili di espressione genica analizzati dalla tecnologia cDNA microarray e sono disponibili per l’ispezione via Internet (49,50). In questo modo, diversi gruppi in tutto il mondo saranno in grado di confrontare i dati di profili genetici selezionati con altri depositati in banche di dati molecolari come Gene Expression Omnibus o Array Express, progettati dall’Istituto europeo di bioinformatica (51).

Un problema che ha limitato un’interazione benefica tra vari gruppi di ricerca che utilizzano la tecnologia cDNA microarray è la mancanza di standard per la presentazione e lo scambio di risultati. Per compensare questa situazione, sono state create le informazioni minime per l’annotazione di un esperimento Microarray (MIAME) (52). Linee guida che portano alla standardizzazione degli esperimenti di microarray cDNA sono state proposte dalla Micro-array Gene Expression Data Society (MGED). MIAME è fondamentalmente composto da sei sezioni: 1) progettazione sperimentale; 2) progettazione di array; 3) campioni utilizzati, preparati di estratto e ibridazione; 4) procedure e parametri di ibridazione; 5) immagine, quantificazione e misurazione dei parametri e 6) tipi, valori e specifiche per i controlli di normalizzazione. MIAME è diventato un requisito per pubblicare i risultati di cDNA microarray in molte riviste scientifiche. Inoltre, gruppi distinti tra cui MGED, Rosetta, Agilent e Affymetrix hanno lavorato insieme utilizzando la bioinformatica per progettare l’espressione genica microarray (MAGE), che è una piattaforma di struttura flessibile comune che consente la comunicazione tra diversi gruppi di ricerca utilizzando la tecnologia cDNA microarray. MAGE è composto da quanto segue: 1) MAGE – ON (object model), un modello di dati centrico che utilizza un linguaggio di modellazione unificato e implementa i requisiti MIAME; 2) MAGE-ML (markup language), che documenta la traduzione da MAGE-OM a un formato di dati basato su XML, e 3) MAGE-SLK, un software liberamente accessibile che definisce l’interfaccia dei programmatori di applicazioni a MAGE-OM, consentendo così l’esportazione dei dati a MAGE-ML e conseguentemente con conseguente memorizzazione dei dati in un database relazionale (53).

Recentemente, la nanotecnologia è stata ampiamente implementata in varie arene, come applicazioni industriali, farmaceutiche e governative, per migliorare i moderni progressi scientifici. A causa delle caratteristiche fisiche e chimiche uniche delle nanoparticelle, questi materiali hanno la capacità di migliorare i dispositivi sensoriali, gli additivi di propulsione, le tecniche di rimodellamento dei tessuti e i meccanismi di targeting dei farmaci. Inoltre, la nanotecnologia è stata utilizzata per migliorare la competenza microarray (54) e per aiutare nello sviluppo di nanoarray proteici (55). All’interno dell’ambiente di laboratorio, gli scienziati stanno ora iniziando a studiare il potenziale impatto positivo / negativo che le nanoparticelle hanno sull’induzione/inibizione dei geni all’interno delle cellule utilizzando la tecnica microarray (56). Infine, la combinazione della nanotecnologia con la tecnologia microarray ha persino avanzato l’attuale conoscenza dei geni regolati in modo differenziato durante i processi patologici (57,58).

Insieme, questi strumenti possono contribuire alla comprensione di nuove funzioni geniche in diversi genomi e di come si correlano con la patogenesi della malattia nell’uomo. Lo sviluppo e l’applicazione della tecnologia cDNA microarray hanno portato molti progressi alla scoperta di farmaci, diagnostica di ricerca e potenziale terapia genica destinata al trattamento di varie malattie. Questa tecnologia fondamentale aiuta i ricercatori a comprendere i meccanismi molecolari coinvolti in molteplici e diversi processi biologici.

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