ELISA: jak analizować wyniki eksperymentalne

przez Dr. Surat P, Ph. D. recenzowany przez Dr. Tomislav Meštrović, MD, Ph. d.

ELISA, lub enzym-Linked Immunosorbent Assay, jest narzędziem stosowanym do wykrywania i ilościowego oznaczania substancji, takich jak peptydy, białka, przeciwciała i hormony. Polega na unieruchomieniu antygenu lub przeciwciała na powierzchni, a następnie dodaniu próbki do analizy. Wykrywanie zależy od specyficznej reakcji antygen-przeciwciało.

Jaruna Ontakrai |

co zrobić przed uruchomieniem testu ELISA

test ELISA powinien być zawsze wykonywany w replikatach (duplikatach lub triplikatach), aby uzyskać wystarczającą liczbę próbek do obliczenia odchylenia standardowego i współczynnika zmienności. Współczynnik błędu powinien być utrzymany na poziomie poniżej 20%. Jeśli obliczony błąd jest wysoki, należy ocenić błędy powstałe w wyniku pipetowania, zanieczyszczenia płyt i odczynników, parowania i/lub temperatury.

Standardowa krzywa

standardowa krzywa jest używana do pomiaru stężenia próbki. Po pierwsze, wartości absorbancji standardowych stężeń (pg/ml) są wykreślane. Wykonuje się również krzywą ujemną, która nie zawiera żadnych standardowych danych próbki i jest używana do wykrywania i pomiaru szumów tła. Aby uzyskać dokładny pomiar, tę wartość tła należy odjąć od standardowej krzywej.

wartości absorbancji znanego stężenia można wykreślić jako kontrolę dodatnią. Stężenie białka docelowego oblicza się najpierw przez obliczenie średniej absorbancji, a następnie za pomocą krzywej standardowej do oszacowania stężenia.

należy również wziąć pod uwagę współczynniki rozcieńczenia. Na przykład, jeśli próbka została rozcieńczona czterokrotnie, wówczas absorbancję należy pomnożyć przez cztery przed zastosowaniem krzywej standardowej w celu uzyskania stężenia.

współczynnik zmienności

definicją współczynnika zmienności jest stosunek odchylenia standardowego i średniej-tj. odchylenie standardowe (σ) / średnia (µ). Duże wartości współczynnika zmienności wskazują na nieścisłości spowodowane pipetowaniem lub mieszaniem odczynników między studniami, zanieczyszczeniem bakteryjnym lub grzybowym, wysuszeniem studni lub zmianami temperatury.

odzyskiwanie Spike ’ a

wartość uzyskana po przeprowadzeniu testu ELISA zależy od tego, w jaki sposób docelowe białko wchodzi w interakcję z przeciwciałami i tę interakcję porównuje się ze standardową krzywą białka. Kilka czynników-w tym bufor, matryca i przeciwciała heterofilne – może wpływać na Wiązanie próbki, więc należy to wziąć pod uwagę przy określaniu dokładności testu ELISA.

w celu określenia dokładności wyników ELISA można wykonać test spike. W tym teście do próbki dodaje się lub doprawia znaną ilość rekombinowanego białka. Następnie za pomocą krzywej standardowej mierzy się ilość materiału. Duże odchylenia zmierzonych wartości mogą wskazywać na błędy spowodowane nieznanymi elementami w teście.

test liniowości

test liniowości stosuje się również do określenia dokładności testu ELISA. W tym przypadku „próbka z kolcami” jest seryjnie rozcieńczana do wartości 1:2, 1:4 i 1:8. W przypadku wykrycia stężenia zmienionej próbki, a wyniki nie wykazują liniowej zmiany w pomiarach, może to wskazywać na błędy w dokładności testu ELISA.

w niektórych przypadkach błędy mogą być obserwowane w pewnych stężeniach i nie są już obserwowane w niższych stężeniach. W takich przypadkach może być konieczne rozcieńczenie próbki przed wykonaniem pomiarów stężenia.

Rozwiązywanie problemów

hałas w tle może być spowodowany wieloma czynnikami, w tym:

• niewystarczające przemywanie studzienek
• skażone bufory płuczące
• zbyt dużo odczynnika wykrywającego
• reaktywność krzyżowa przeciwciała
• wytrącanie buforu i/lub analitu

czasami może być generowana zła krzywa wzorcowa. Może to być spowodowane błędami w roztworze wzorcowym, degradacją wzorca, nieprawidłowym odtworzeniem wzorca lub jeśli krzywa nie pasuje do skali. Biorąc pod uwagę to ostatnie, wykresy można wykonywać za pomocą różnych skal, takich jak log-log lub 5-parametrowa krzywa logistyczna.

Czytaj dalej

• wszystkie enzymatyczne testy Immunosorbentów (ELISA) zawartość
• zastosowania ELISA
• Technika Western Blot-Lab stosowana do wykrywania białek
• zastosowania przeciwciał
• pomiar ekspresji genu

Written by

Dr. Surat P

Dr. Surat ukończył studia doktoranckie. w biologii komórki i Mechanobiologii z Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, Indie) w 2016 roku. Przed doktoratem Surat studiowała na Bachelor of Science (B.Sc.) dyplom z zoologii, podczas którego była stypendystką Letniej Akademii Nauk Indian Academy of Sciences, aby badać białka zaangażowane w AIDs. Tworzy artykuły fabularne na szeroki zakres tematów, takich jak etyka medyczna, manipulacja danymi, pseudonauka i przesądy, Edukacja i ewolucja człowieka. Pasjonuje się komunikacją naukową i pisze artykuły dotyczące wszystkich dziedzin nauk przyrodniczych.

cytowania