PMC

oznaczanie RNA HCV.

celem tego badania było opracowanie prostego testu QRT-PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego oznaczania HCV RNA zarówno w surowicy, jak i próbkach wątroby z wykrywaniem SYBR Green I zamiast stosowania znakowanych sond. Testy QRT-PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono za pomocą LightCycler (Roche) zarówno z jedno-okrągłym wzmocnieniem, jak i nowym, zagnieżdżonym wzmocnieniem o ograniczonym cyklu. Normy RNA transkrybowano polimerazą T7 z amplikonów pochodzących z 5 ’ nieprzetłumaczonych produktów PCR regionu sklonowanych do pGEM-t Easy (Promega)i traktowano dwukrotnie Dnazą Rq1. RNA oznaczano ilościowo za pomocą spektrofotometrii. W przypadku jednokrotnego oznaczania ilościowego próbek surowicy RNA poddano odwrotnej transkrypcji, jak opisano wcześniej (7). Do oznaczania ilościowego zagnieżdżonego PCR w ograniczonym cyklu, RT-PCR przeprowadzono w jednoetapowej reakcji z 15 cyklami PCR (etap o ograniczonym cyklu), a następnie QRT-PCR w czasie rzeczywistym. Obciążenia HCV mierzono metodą PCR w czasie rzeczywistym z zewnętrznymi starterami KY78 i KY80 dla reakcji jednoobrotowych (21) lub zewnętrznymi starterami i wewnętrznymi starterami hep21b i hep22 dla reakcji zagnieżdżonych o ograniczonym cyklu (19). Mieszaniny reakcyjne obejmowały 2 µl wzorca szybkiego startu DNA SYBR Green I (Roche), 4 mM MgCl2, stężenie 0,5 µM każdego startera i 2 µl szablonu w całkowitej objętości 20 µl. Po inkubacji przez 10 minut w 95°C, LightCycler PCR przeprowadzano przez 40 cykli, każdy cykl składał się z 15 s w 95°C, wyżarzania w 60°C przez 5 s i przedłużania w 72°C przez 10 s. Fluorescencję monitorowano przy 530 nm, a specyficzność sygnału sprawdzano za pomocą analizy krzywej topnienia.

z syntetycznym RNA HCV jako wzorem, czułość testu QRT-PCR w czasie rzeczywistym wynosiła około 103 kopii HCV / reakcję lub 5 × 104 kopii / ml, gdy obliczono współczynnik rozcieńczenia. Zaobserwowano szeroką zależność liniową (do 6,5 × 108 kopii / reakcję) między liczbą cykli PCR potrzebnych do wykrycia sygnału fluorescencji a liczbą kopii HCV. Mierzyliśmy miano wirusa w surowicy 24 pacjentów przewlekle zakażonych różnymi genotypami HCV rozpowszechnionymi w Australii (1a, 1b, 2a, 2b, 2c i 3a) (6). U trzech pacjentów miano wirusa było niższe niż czułość tej wersji testu (5 × 104 kopii/ml), chociaż wynik był dodatni w wyniku jakościowego wewnętrznego testu RT-PCR (19). U pozostałych 21 pacjentów miano wirusa wynosiło od 2, 8 × 105 do 9, 1 × 106 kopii/ml. Aby zwiększyć czułość i swoistość testu, wprowadzono 15-cyklowy, jednoetapowy RT-PCR z kolejnym ilościowym PCR w czasie rzeczywistym dla drugiej rundy. Dzięki syntetycznemu RNA zmodyfikowana metoda była w stanie wykryć szeroki zakres kopii HCV (od 28 do 2,8 × 106 kopii/reakcji HCV) przy zachowaniu liniowości. Czułość zagnieżdżonego testu QRT-PCR z ograniczonym cyklem była większa niż 28 kopii/reakcję (lub 1400 kopii/ml), co było około 40 razy większe niż w przypadku testu QRT-PCR z pojedynczym cyklem. Czułość tego testu jest korzystna w porównaniu z wcześniej opisanymi metodami oznaczania ilościowego w czasie rzeczywistym za pomocą technologii TaqMan (Roche) i systemu detekcji sekwencji ABI Prism 7700 (Perkin-Elmer), które wykazały czułość 10 kopii/reakcję (9, 16) i 1000 kopii/reakcję (12). Stwierdzono również, że czułość wykrywania LightCycler (Roche) i SYBR Green I wynosi 10 kopii / reakcja (10). W celu dalszego potwierdzenia tej wersji testu, miano wirusa w 16 próbkach surowicy HCV-dodatnich wynosiło od 1 × 103 do 1.Wykazano, że 2 × 106 kopii/ml (oznaczonych metodą Amplicor Monitor) ściśle koreluje z wynikami uzyskanymi w zagnieżdżonym teście QRT-PCR w czasie rzeczywistym (R= 0, 876, P < 0, 0001, N = 16) (Fig. (Rys.11).

HCV replikuje się w wątrobie, jednak w niewielu badaniach próbowano powiązać miana wirusa w wątrobie z wynikami klinicznymi, preferując badanie wartości prognostycznej miana wirusa w surowicy. Te ostatnie można uznać za odpowiednie zastępcze dla wirusowego miana wątroby, jeśli wykazano korelację, jednak kilka badań wykazało to i wyniki zgłaszane do tej pory nie są przekonujące. W związku z tym do pomiaru stężenia HCV w wątrobie zastosowano zagnieżdżony test QRT-PCR z ograniczonym cyklem. Ilość tkanki wątroby użytej do analizy ważyła od 0,8 do 8,1 mg (średnia = 3.88 ± 2,1 mg), z którego ekstrahowano 2,1 do 12,9 µg (średnia = 6,62 ± 3,1 µg) RNA. Wydajność całkowitego RNA wynosiła średnio 1,71 × 103 µg/g tkanki wątroby, wartość podobna do tej stwierdzonej we wcześniejszym badaniu 1,01 × 103 µg RNA/g (13). Miana wirusa w wątrobie wahała się od 3, 0 × 102 do 1, 3 × 106 cząsteczek RNA HCV/µg całkowitego RNA, a średnia wynosiła 2, 38 × 105 ± 3, 55 × 105 kopii/µg RNA. Wykazano korelację pomiędzy mianem wirusa w wątrobie, mierzonym pod względem liczby kopii HCV na mikrogram całkowitego RNA, a mianem wirusa w surowicy mierzonym za pomocą testu Amplicor Monitor, chociaż był on słaby (r = 0, 417, n = 20) (13). Inne badania wykazały, że poziom HCV RNA w surowicy jest zasadniczo odzwierciedlany przez ilość wirusa w wątrobie bez podania współczynników korelacji (3, 8). Tutaj po raz pierwszy zgłaszamy statystycznie istotną korelację pomiędzy pomiarem miana wirusa w wątrobie i surowicy (r = 0,689, P = 0.004, n = 15), co wskazuje, że poziom wiremii w rzeczywistości odzwierciedla ilość wirusa obecnego w wątrobie (Fig. (Rys.22).

w poprzednich badaniach pomiary miana wirusa w wątrobie wyrażano jako liczbę kopii na miligram tkanki wątroby lub liczbę kopii na mikrogram całkowitego RNA. W tym badaniu wykazujemy, że każda jednostka wydaje się odpowiednia, ponieważ istniała znacząca korelacja między mianami wirusa mierzonymi pod względem liczby kopii na miligram tkanki wątroby a tymi mierzonymi jako liczba kopii na mikrogram całkowitego RNA (R = 0,937, P < 0,0001, N = 20) (Fig. (Rys.3).3). Wyniki te są zgodne z wynikami de Moliner et al. (3), który wykazał również ścisłą korelację między mianem wirusa w wątrobie, wyrażonym jako liczba kopii na gram tkanki, a liczbą kopii na mikrogram całkowitego komórkowego RNA (r = 0,85) (3). Średnia liczba cząsteczek RNA HCV na gram tkanki wątroby wynosiła 2,1 × 108 ± 3,71 × 108, około 170 razy więcej niż poziomy RNA w surowicy (1,22 × 106 ± 2,0 × 106 kopii/ml). To odkrycie jest podobne do tego z Terrault et al. (18), who wykazał, że stosunek HCV RNA w wątrobie do stężenia w surowicy wynosił 103:1. Natomiast McGuiness et al. (13) stwierdzono, że poziom w tkance wątroby był większy o czynnik >104. Różnica ta może wiązać się z faktem, że miano wirusa w wątrobie u pacjentów w poprzednim badaniu, którzy w przeważającej mierze mieli zaawansowane zakażenie HCV, było około ośmiokrotnie większe (1, 83 × 106 ± 0, 75 × 106 kopii/µg RNA) niż u pacjentów zarejestrowanych w obecnym badaniu (2, 38 × 105 ± 3, 55 × 105 kopii/µg RNA).

podsumowując, test QRT-PCR w czasie rzeczywistym jest czułą, dokładną i wiarygodną metodą monitorowania stężenia HCV zarówno w surowicy, jak i próbkach wątroby.