PMC

cuantificarea ARN VHC.

scopul acestui studiu a fost de a dezvolta un test QRT-PCR simplu, în timp real, pentru cuantificarea ARN-ului VHC atât în probele serice, cât și în cele hepatice, cu detectare SYBR Green i, mai degrabă decât utilizarea sondelor marcate. Testele QRT-PCR în timp real au fost efectuate cu un LightCycler (Roche) atât cu amplificare cu o singură rundă, cât și cu o nouă amplificare imbricată cu ciclu limitat. Standardele ARN au fost transcrise cu polimeraza T7 din ampliconi derivați din regiunea netradusă 5 ‘ produse PCR clonate în Pgem-t Easy (Promega) și tratate de două ori cu RQ1 DNase. ARN-ul a fost cuantificat prin spectrofotometrie. Pentru cuantificarea cu o singură rundă a probelor serice, ARN-ul a fost transcris invers așa cum s-a descris anterior (7). Pentru cuantificarea PCR imbricată cu ciclu limitat, un RT-PCR a fost efectuat într-o reacție într-o singură etapă cu 15 cicluri de PCR (etapa cu ciclu limitat), urmată de un QRT-PCR în timp real. Sarcinile VHC au fost măsurate prin PCR în timp real cu primeri exteriori KY78 și KY80 pentru reacții cu o singură rundă (21) sau primeri exteriori plus primeri interiori hep21b și hep22 pentru reacții imbricate cu ciclu limitat (19). Amestecurile de reacție au inclus 2 unqql de ADN Master SYBR Green I (Roche), 4 mM MgCl2, o concentrație de 0,5 oqqm din fiecare grund și 2 oqql din șablon într-un volum total de 20 oqql. În urma incubațiilor timp de 10 min la 95 CTC, PCR LightCycler s-a efectuat timp de 40 de cicluri, fiecare ciclu constând din 15 s la 95 CTC, recoacere la 60 CTC pentru 5 CT, și extensie la 72 CTC pentru 10 ct. Fluorescența a fost monitorizată la 530 nm, iar specificitatea semnalului a fost verificată prin analiza curbei de topire.

cu ARN VHC sintetic ca șablon, sensibilitatea testului QRT-PCR în timp real cu o singură rundă a fost de aproximativ 103 copii/reacție VHC sau 5 104 copii/ml la calcularea factorului de diluare. S-a observat o relație liniară largă (până la 6,5 XCT 108 copii/reacție) între numărul de cicluri PCR necesare detectării unui semnal de fluorescență și numărul de copii VHC. Am măsurat încărcăturile virale serice la 24 de pacienți infectați cronic cu diferite genotipuri VHC predominante în Australia (1a, 1b, 2a, 2b, 2c și 3a) (6). Trei pacienți au prezentat încărcături virale sub sensibilitatea acestei versiuni a testului (5 104 copii/ml), deși au fost pozitivi printr-un test calitativ RT-PCR imbricat intern (19). Restul de 21 de pacienți au prezentat încărcături virale care au variat de la 2,8 la 105 la 9,1 la 106 copii / ml. Pentru a crește sensibilitatea și Specificitatea testului, a fost introdus un RT-PCR cu 15 cicluri, cu un pas, cu un PCR cantitativ în timp real ulterior pentru a doua rundă. Cu ARN sintetic, metoda modificată a fost capabilă să detecteze o gamă largă de numere de copii VHC (de la 28 la 2,8 106 copii VHC/reacție), menținând în același timp liniaritatea. Sensibilitatea testului QRT-PCR imbricat cu ciclu limitat a fost mai mare de 28 copii/reacție (sau 1400 copii/ml), care a fost de aproximativ 40 de ori mai mare decât cea a testului QRT-PCR cu o singură rundă. Sensibilitatea acestui test se compară favorabil cu cele ale metodelor raportate anterior folosind cuantificarea în timp real cu tehnologia TaqMan (Roche) și un sistem de detectare a secvenței ABI Prism 7700 (Perkin-Elmer), care au raportat sensibilități de 10 exemplare/reacție (9, 16) și 1.000 de exemplare/reacție (12). Sensibilitatea detectării LightCycler (Roche) și SYBR Green I a fost, de asemenea, raportată la 10 copii/reacție (10). Pentru a valida în continuare această versiune a testului, încărcăturile virale de 16 probe serice VHC-pozitive, care au variat de la 1 la 103 la 1.S-a demonstrat corelarea strânsă cu rezultatele obținute cu testul QRT-PCR imbricat în timp real (R= 0,876, P < 0,0001, N = 16) (Fig. (Fig.11).

HCV se reproduce în ficat, dar puține studii au încercat să coreleze încărcăturile virale din ficat cu rezultatele clinice, preferând să examineze valoarea predictivă a încărcăturilor virale serice. Acesta din urmă ar putea fi considerat un surogat adecvat pentru încărcăturile virale hepatice dacă s-ar demonstra că se corelează, totuși puține studii au arătat acest lucru, iar rezultatele raportate până în prezent nu sunt convingătoare. Prin urmare, testul QRT-PCR imbricat cu ciclu limitat a fost utilizat pentru măsurarea sarcinilor hepatice VHC. Cantitatea de țesut hepatic utilizată pentru analiză a cântărit între 0, 8 și 8, 1 mg (medie = 3.88 XT 2,1 mg), din care s-a extras 2,1 până la 12,9 XT (media = 6,62 XT 3,1 XT) de ARN. Randamentul ARN-ului total a fost în medie de 1,71 XTX 103 XTX/g de țesut hepatic, o valoare similară cu cea găsită într-un studiu anterior de 1,01 XTX 103 XTX de ARN/g (13). Hepatică încărcătura virală a variat de la 3.0 × 102 la 1,3 × 106 molecule de ARN VHC/µg de ARN-ul total, iar media a fost de 2,38 × 105 ± 3.55 × 105 copii/µg de ARN. S-a demonstrat o corelație între încărcăturile virale hepatice, măsurate în ceea ce privește numărul de copii VHC per microgram de ARN total, și încărcăturile virale serice măsurate cu testul Amplicor Monitor, deși a fost slab (r = 0,417, n = 20) (13). Alte studii au arătat că încărcarea ARN VHC în ser este reflectată substanțial de cantitatea de virus din ficat fără a furniza coeficienți de corelație (3, 8). Aici, raportăm pentru prima dată o corelație semnificativă statistic între măsurătorile încărcăturii virale hepatice și serice (r = 0,689, P = 0.004, n = 15), indicând faptul că nivelul viremiei reflectă, de fapt, cantitatea de virus prezentă în ficat (Fig. (Fig.22).

în studiile anterioare, măsurătorile încărcăturii virale hepatice au fost exprimate ca numărul de copii pe miligram de țesut hepatic sau numărul de copii pe microgram de ARN total. În acest studiu, am arătat că fiecare unitate pare a fi adecvată, deoarece a existat o corelație semnificativă între încărcăturile virale măsurate în ceea ce privește numărul de copii pe miligram de țesut hepatic și cele măsurate ca numărul de copii pe microgram de ARN total (R = 0,937, P < 0,0001, N = 20) (Fig. (Fig.3).3). Aceste rezultate sunt în concordanță cu cele ale lui de Moliner și colab. (3), care a demonstrat, de asemenea, o corelație strânsă între încărcătura virală din ficat, exprimată ca număr de copii pe gram de țesut și numărul de copii pe microgram de ARN celular total (r = 0,85) (3). Numărul mediu de molecule de ARN VHC pe gram de țesut hepatic a fost de 2,1 × 108 ± 3.71 × 108, în jur de 170 de ori mai mare decât VHC în ser (1.22 × 106 ± 2.0 × 106 copii/ml). Această constatare este similară cu cea a Terrault și colab. (18), OMS a arătat că raportul dintre ARN VHC în ficat și cel din ser a fost de 103:1. În schimb, McGuiness și colab. (13) a constatat că nivelul în țesutul hepatic a fost mai mare cu un factor de >104. Această diferență se poate referi la faptul că hepatică virală mulțime de pacienți în studiul anterior, care preponderent au avansat infectia cu VHC, au fost în jur de opt ori mai mare (1.83 × 106 ± 0.75 × 106 copii/µg de ARN) decât cele înregistrate în studiul de față (2.38 × 105 ± 3.55 × 105 copii/µg de ARN).

în concluzie, testul QRT-PCR în timp real este o metodă sensibilă, precisă și fiabilă pentru monitorizarea încărcărilor VHC atât în probele serice, cât și în cele hepatice.