Braz J Med Biol Res, mai 2004, volum 37(5) 625-634
utilizarea transcripției inverse-PCR pentru diagnosticul bolii granulomatoase cronice X-linked
P. Agudelo-FL Oktarz1, J. A. L Inktpez1, J. Redher1, M. M. S. Carneiro-Sampaio2, B. T. Costa-Carvalho3, A. S. Grumach4 și A. Condino-Neto1
1centro de Investigaquxo em pediatria, și departamentele de pediatrie și farmacologie, Facultatea de științe Medicale, Universitatea de Stat din Campinas, Campinas, SP, Brazilia
2departamento de imunologie, Institutul de Stiinte Biomedicale, Universidade de S Inkto Paulo, s Inkto Paulo, SP, Brazilia.
3Disciplina de alergie, Imunologie și Reumatologie, Departamentul de Pediatrie, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de S Inkto Paulo, s Inkto Paulo, SP, Brazilia.
4laborat unixtrio Cercetare Medicală 56, Departamentul de Dermatologie, Facultatea de Medicină,, Universidade de S Inkto Paulo, s Inkto Paulo, SP, Brazilia
rezumat Introducere
pacienți și metode rezultate
discuție mulțumiri
corespondență și note de subsol
rezumat
boala granulomatoasă cronică (CGD) este o tulburare moștenită a sistemului imunitar înnăscut caracterizată printr-o explozie oxidativă defectuoasă a fagocitelor și afectarea ulterioară a activității lor microbicide. Mutațiile uneia dintre componentele NADPH-oxidazei afectează expresia sau funcția genică a acestui sistem, ducând la fenotipul CGD. Defectele gp91-phox duc la CGD legat de X, responsabil pentru aproximativ 70% din cazurile de CGD. Investigarea genotipului extrem de eterogen al pacienților cu CGD include analiza mutațiilor, testele Northern blot sau Western blot în funcție de cazul particular. Scopul prezentului studiu a fost de a utiliza transcripția inversă (RT)-PCR pentru analiza defectelor moleculare responsabile de CGD legat de X la opt pacienți brazilieni și de a evalua potențialul său de aplicare mai largă la screeningul molecular în CGD. ARN-ul Total a fost preparat din limfocitele B transformate de virusul Epstein B și transcris invers folosind hexameri aleatori. ADNc rezultat a fost PCR-amplificat de perechi specifice și suprapuse de primeri concepute pentru a amplifica trei regiuni ale genei gp91-phox: exonii 1-5, 3-9 și 7-13. Această strategie a detectat expresia defectuoasă gp91-phox la șapte pacienți. Rezultatele RT-PCR au corespuns istoricului clinic, datelor biochimice (testul de eliberare a tetrazolului nitroblue sau superoxid) și analizei mutațiilor disponibile în patru cazuri. În alte trei cazuri, rezultatele RT-PCR au corespuns istoricului clinic și datelor biochimice. Într-un alt caz, RT-PCR a fost normal, în ciuda unui istoric clinic compatibil cu CGD și a unei explozii respiratorii defecte. Concluzionăm că această nouă aplicație a analizei RT-PCR – o metodă simplă, economică și rapidă – a fost adecvată pentru depistarea defectelor moleculare la 7 din 8 pacienți cu CGD X-linked.
cuvinte cheie: superoxid, fagocite, imunodeficiență primară, explozie respiratorie, neutrofile, uman
Introducere
boala granulomatoasă cronică (CGD) este o imunodeficiență primară descrisă inițial în 1957 ca o entitate clinică care afectează sugarii de sex masculin și numită, la acea vreme, boala granulomatoasă fatală a copilăriei. Principalele caracteristici ale CGD sunt infecțiile recurente și severe care implică barierele naturale ale organismului, cum ar fi tractul respirator și ganglionii limfatici și, în cele din urmă, structurile interne, cum ar fi ficatul, splina, oasele și creierul (1-3). Incidența estimată a acestei boli rare este de 1/250.000 de nașteri vii pe an. Infecțiile sunt în general cauzate de bacterii catalazice negative, cum ar fi Staphylococcus aureus, bacili Gram-negativi și specii fungice, cum ar fi Aspergillus, Candida și Nocardia (4,5).
sistemul NADPH-oxidază generează superoxid și alți intermediari reactivi de oxigen, esențiali pentru activitatea microbicidă a fagocitelor. Defectul biochimic al CGD este o afectare a activității NADPH-oxidazei și incapacitatea ulterioară de a distruge microorganismele (6). Principalele componente ale sistemului NADPH-oxidază sunt gp91-, p22-, p47-, p67-și p40-phox. Defectele moleculare care cauzează CGD se datorează, în general, absenței, expresiei scăzute sau funcționării defectuoase a uneia dintre componentele NADPH-oxidazei. Forma legată de X a acestei boli este cauzată de defecte în gp91-phox, lanțul greu al citocromului b588 și reprezintă aproximativ 70% din toate cazurile (7,8). Formele autozomale recesive sunt cauzate de defecte ale uneia dintre componentele citosolice ale NADPH oxidazei (p47 – sau p67-phox, respectiv în 20 și 5% din cazuri) sau a componentei lanțului ușor al citocromului b588 (p22-phox, 5% din cazuri) (9,10). CGD este o afecțiune extrem de eterogenă: peste 300 de mutații au fost înregistrate într-o bază de date X-CGD întreținută la nivel internațional (8). Mutațiile au fost distribuite în mare parte în cadrul celor 13 exoni sau la limitele exonului/intronului genei gp91-phox (CYBB) și aproape 200 dintre aceste mutații sunt unice.
diagnosticul CGD se bazează, în general, pe caracteristicile clinice ale bolii plus activitatea NADPH-oxidazei defecte, demonstrată prin teste anormale de tetrazoliu nitroblue (NBT), dihidrorhodamină 123 sau teste de eliberare a superoxidului (11,12). În testul NBT stimulat, indivizii normali prezintă aproape 100% celule pozitive, în timp ce la pacienții cu CGD mai puțin de 5% din celule sunt pozitive (13). În plus, celulele de la pacienții cu varianta CGD sunt pozitive, dar prezintă doar o activitate foarte scăzută (6). Testul NBT detectează, de asemenea, purtătorii CGD legați de X (mame și surori). Un diagnostic definitiv de CGD molecular este stabilit la pacienții cu un test NBT anormal sau cu activitate respiratorie de spargere care au una dintre următoarele caracteristici: o mutație în gp91-, p22-, p47-sau P67-phox; ARNm absent pentru una dintre aceste gene detectate prin analiza Northern blot; și/sau proteine absente pentru una dintre aceste componente ale oxidazei de către Western blot. Un diagnostic genetic, dar nu molecular, poate fi stabilit prin demonstrarea verilor, unchilor sau nepoților materni cu un test NBT anormal sau o explozie respiratorie (14). Astfel, stabilirea unui diagnostic definitiv al acestei boli rare și extrem de eterogene necesită metodologii complexe și costisitoare, cum ar fi o combinație de Northern blot sau Western blot, și analiza polimorfismului conformației cu un singur fir (SSCP) urmată de secvențierea ADN a mai multor membri ai familiei, toate efectuate în laboratoare de cercetare de înaltă complexitate.
metoda transcripției inverse-PCR (RT-PCR) implică amplificarea ADNc prin PCR. Această tehnică poate fi ușor standardizată în laboratoare mai puțin sofisticate. Oferă informații despre expresia genelor și date preliminare despre structura sau dimensiunea ARNm a componentei defecte. RT-PCR a fost rar utilizat în cercetarea CGD, fiind limitat la studii de Fiziopatologie (15-29). Până în prezent, utilizarea potențială a acestui instrument util pentru stabilirea diagnosticului definitiv al CGD legat de X, cea mai frecventă formă, nu a fost investigată pe larg. Scopul prezentului studiu a fost de a evalua utilizarea RT-PCR pentru depistarea defectelor moleculare responsabile de CGD legat de X, o imunodeficiență rară și posibil diagnosticată greșit, la opt pacienți Brazilieni.
pacienți și metode
pacienți
studiul a inclus 8 pacienți brazilieni de sex masculin fără legătură cu CGD probabil legat de x (2 negri și 6 caucazieni; vârstă 2-8 ani; înălțime 88-108 cm; Greutate 11-19 kg). Pacienții au prezentat antecedente clinice de infecții severe recurente, cum ar fi pneumonie, limfadenită, abces hepatic, piodermită și reacții adverse la imunizarea BCG. Acestea au fost trimise la laboratorul nostru pentru evaluarea diagnosticului biochimic și molecular. Consimțământul informat scris a fost obținut de la participanți înainte de studiu. Comitetul de etică al școlii Medicale a aprobat protocolul în conformitate cu Convenția de la Helsinki și Ministerul Sănătății din Brazilia, rezoluția 196/96.
diagnosticul biochimic al CGD
diagnosticul biochimic al CGD a fost stabilit conform criteriilor grupului Pan American pentru imunodeficiențe. O afectare a activității NADPH-oxidazei a fost demonstrată prin testul de diapozitive NBT și/sau testul de eliberare a anionului superoxid de către neutrofilele din sângele periferic și leucocitele mononucleare (14,30,31). Neutrofilele și leucocitele mononucleare au fost obținute prin centrifugarea probelor de sânge pe un gradient de densitate Ficoll-Hypaque (32).
testul de diapozitive NBT s-a bazat pe reducerea NBT la formazan prin leucocite activate (31). Testul a fost efectuat conform descrierii anterioare (30). Mai mult de 95% din 200 de neutrofile normale stimulate cu 30 nM phorbol 12-miristat 13-acetat (PMA) ar trebui să poată reduce NBT. S-a considerat că reacția absentă sau <5% celule pozitive indică un diagnostic de CGD (14).
eliberarea cantitativă de superoxid de către neutrofile și leucocite mononucleare a fost evaluată printr-un test modificat de reducere a citocromului C inhibabil de superoxid dismutază (33-35). Cantitatea de superoxid eliberată a fost calculată folosind un coeficient de extincție de 0,21 nM/cm pentru citocromul c. rezultatele sunt raportate ca superoxid de nmol eliberat de 106 celule pe oră. Pacienții cu CGD au prezentat mai puțin de 10% din valorile de control.
depistarea defectelor moleculare responsabile de CGD X-linked
limfocitele B de la pacienții cu CGD X-linked au fost transformate in vitro cu virusul Epstein B (EBV) (15,16) pentru a furniza o sursă abundentă de acizi nucleici pentru studiile moleculare. Liniile de celule B transformate de EBV reproduc defectele biochimice și moleculare ale pacienților cu CGD (15,16,36) și elimină necesitatea colectărilor repetate de sânge. Pe scurt, leucocitele din sângele periferic de la pacienții cu CGD X-linked au fost cultivate cu supernatanți din B95-8, o linie celulară producătoare de EBV (15,16,36,37), în mediu RPMI 1640 suplimentat cu ser fetal bovin inactivat termic (10%), 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină și 100 centic/ml streptomicină, la 37 CENTICC, într-o atmosferă umedă cu 5% CO2. Viabilitatea celulară a fost monitorizată și culturile au fost menținute pe toată perioada studiului.
probele de ARN din liniile de celule B transformate în EBV au fost preparate prin metoda guanidinei HCl, urmată de precipitarea etanolului și cuantificarea prin metode standard (38,39). Probele de ADNc au fost obținute prin transcrierea inversă a 2 hectog de ARN total cu SuperScript II RT (GIBCO BRL) și hexameri aleatori (15). Calitatea probelor de ARNm a fost verificată prin amplificarea PCR a actinei-actinei, un control al genei constitutive (bp 920-943 și bp 1494-1471) (aderarea gen Bank nr. NM001101).
expresia genei gp91-phox a fost evaluată prin RT-PCR. Perechi specifice și suprapuse de primeri (gen Bank accession nr. NM_000397, Tabelul 1) au fost utilizate pentru a amplifica (30 de cicluri) trei regiuni exonice gp91-phox: 1-5, 3-9 și 7-13. Această strategie ne-a permis să examinăm toți exonii gp91-phox. Produsele PCR au fost analizate prin electroforeză în gel de agaroză 2% și colorate cu bromură de etidiu.
expresia relativă a genei gp91-phox a fost analizată cu software-ul Image Master (Pharmacia-Biotech). Rezultatul densitometriei pentru probele țintă a fost împărțit la rezultatul densitometriei de actină-actină, un control al genei constitutive, normalizând nivelul luat în considerare pentru analiză. Rezultatele testelor RT-PCR au fost comparate cu istoricul clinic al pacientului, testele biochimice (NBT și/sau testul de eliberare a superoxidului) și datele disponibile de analiză a mutațiilor (http://www.sbi.org.br/Sbi2003/ index.htm).
rezultate
am studiat 8 pacienți de sex masculin cu antecedente clinice de infecții severe recurente, s-au referit la laboratorul nostru pentru diagnosticul biochimic și molecular al CGD. Rezultatele testelor de diapozitive NBT și ale testelor de eliberare a superoxidului sunt prezentate în tabelul 2. Șase dintre pacienți au prezentat mai puțin de 5% leucocite pozitive în testul de diapozitive NBT. Șase pacienți au prezentat o eliberare de superoxid afectată de granulocite și / sau leucocite mononucleare (mai puțin de 10% comparativ cu controalele sănătoase). Patru pacienți au avut rezultate anormale la ambele teste. Toți pacienții au prezentat cel puțin un test anormal și au primit diagnosticul de CGD probabil legat de X. Mama și sora pacientului T. B. P. au prezentat un test de diapozitive NBT compatibil cu starea purtătorului CGD legat de X. În timpul perioadei de studiu, un pacient (G. M.) a murit din cauza pneumoniei.
am investigat apoi diagnosticul definitiv al CGD legat de X prin analiza RT-PCR a expresiei genei gp91-phox. Rezultatele amplificării RT-PCR cu trei seturi de grunduri suprapuse sunt prezentate în tabelul 2. Calitatea probei de ARNm a fost verificată prin amplificarea PCR a actinei-actină, un control al genei constitutive. Produsele normale așteptate au fost obținute în acest caz (Figurile 1, 2 și 3).
în patru cazuri, a fost posibil să se potrivească datele RT-PCR cu analiza mutațiilor disponibile, prezentată în altă parte de Pati inject și colab. (30) sau de grupul nostru ( //www.sbi.org.br/Sbi2003/index.htm): J. E. M. a prezentat o tranziție C469 T în exonul 5, prezicând o mutație nonsens (R157X). M. F. a prezentat o substituție nonsens în exon 3, R (arginină) 73-Stop. R. S. a prezentat o substituție de 264 G Inqc la joncțiunea de îmbinare 3′ a exonului gp91-phox 3. Secvența ADNc a arătat o ștergere a exonului gp91-phox 3, dând naștere unui mutant instabil sau nefuncțional gp91-phox. G. G. a prezentat o îmbinare defectuoasă a exonului gp91-phox 3 (mutația de bază nu a fost încă determinată). Ceilalți pacienți continuă să fie investigați.
în ansamblu, această strategie a permis Detectarea expresiei defecte gp91-phox la șapte din opt pacienți. Rezultatele RT-PCR au corespuns istoricului clinic, datelor biochimice (NBT sau testul de eliberare a superoxidului) și analizei mutațiilor disponibile în patru cazuri. În alte trei cazuri, rezultatele RT-PCR au corespuns istoricului clinic și datelor biochimice. Într-un alt caz, RT-PCR a fost normal, în ciuda unui istoric clinic compatibil cu CGD, o explozie respiratorie defectă caracterizată prin testul NBT și testul de eliberare a superoxidului și testele NBT ale mamei și surorii sale compatibile cu statutul de purtător CGD legat de X.
discuție
această lucrare raportează studiile biochimice și de expresie genetică a 8 pacienți brazilieni de sex masculin fără legătură cu antecedente clinice de CGD, care au fost îndrumați la laboratorul nostru pentru investigații detaliate. CGD este o tulburare moștenită rară în care celulele fagocitare nu sunt capabile să genereze anion superoxid și alți intermediari reactivi de oxigen. Am stabilit inițial diagnosticul de CGD probabil legat de X prin metode biochimice, cum ar fi testele de diapozitive NBT și/sau testele de eliberare a anionului superoxid. Rezultatele noastre au arătat că toți pacienții au prezentat afectarea funcției NADPH-oxidazei și, la rândul lor, probabil CGD legat de X.
ambele metode contribuie la diagnosticarea probabilă a CGD în moduri diferite. Testul de diapozitive NBT oferă informații despre numărul de celule care reduc NBT la formazan în interiorul citoplasmei și intensitatea acestei reduceri. Astfel, pacienții cu forme variate de CGD legate de X prezintă teste anormale de diapozitive NBT, în care majoritatea celulelor reduc slab NBT la formazan. Testul de diapozitive NBT detectează, de asemenea, purtătorii de sex feminin de CGD legat de X. Testul de eliberare a superoxidului măsoară reducerea citocromului c de către superoxidul produs de leucocitele activate prezente în reacție, permițând diagnosticarea formelor variante de CGD legat de X. Ambele teste pot fi ușor standardizate în laboratoare de complexitate redusă și nici nu necesită echipamente scumpe. Testul dihidrorodaminei 123 este o metodă extrem de sensibilă pentru diagnosticul biochimic al CGD; cu toate acestea, necesită un Citometru de flux, un instrument foarte scump.
am evaluat expresia genei gp91-phox în limfocitele B transformate EBV de la pacienții cu CGD prin analiza RT-PCR. Perechi specifice și suprapuse de primeri au fost utilizate pentru a amplifica trei regiuni ale genei gp91-phox prin RT-PCR: exonii 1-5, 3-9 și 7-13. Această strategie a permis Detectarea expresiei defecte gp91-phox la 7 din 8 pacienți. Rezultatele RT-PCR au corespuns istoricului clinic, datelor biochimice (NBT sau testul de eliberare a superoxidului) și analizei mutațiilor disponibile în patru cazuri. În alte trei cazuri, rezultatele RT-PCR au corespuns istoricului clinic și datelor biochimice.
expresia genei gp91-phox a fost redusă în toate regiunile exonice ale pacientului R. B. Această reducere poate fi rezultatul mutațiilor care duc la o stabilitate scăzută a ARN sau la o activitate transcripțională modificată. Pacienții G. M. și T. P. a arătat o expresie absentă a exonilor 7-13, sugerând că expresia scăzută a acestor exoni suplimentari 3′-end poate fi rezultatul instabilității ARN sau a unui defect de îmbinare, de exemplu, îmbinarea parțial corectă pentru a produce un semnal, dar îmbinarea parțial anormală pentru a elimina un situs de legare a primerului, subiect care va fi investigat de viitoarele analize de mutație genomică a ADN-ului.
pacientul G. G. a prezentat un produs difuz, cu abundență redusă, de dimensiuni mai mici al exonilor 1-5 (Figura 1) și o expresie absentă a altor regiuni exonice. Analiza mutației a arătat un defect la locul de îmbinare a exonului 3. În mod similar, analiza mutației pacientului R. S. a relevat, de asemenea, un defect la locul de îmbinare exon 3. Cu toate acestea, în acest caz, ar putea fi detectat un produs PCR mai puțin abundent.
pacientul M. F. a prezentat expresia redusă a regiunilor exonice 3-9 și 7-13, care poate fi rezultatul activității transcripționale defecte în exonul 3. J. E. M. a prezentat o mutație nonsens în exonul 5 care a dus la pierderea expresiei gp91-phox, după cum reiese din analiza RT-PCR, o posibilă consecință a instabilității ARNm mediate de prostii.
într-un caz, pacientul T. P. B., expresia genei gp91-phox a fost normală, în ciuda unui istoric familial compatibil cu CGD și a unei activități defecte de explozie respiratorie. În acest caz, diagnosticul de CGD probabil legat de X s-a bazat pe teste NBT anormale la mama și sora sa, compatibile cu statutul de purtător. Presupunem că o mutație punctuală, cum ar fi o singură substituție de bază care nu modifică lungimea sau abundența fragmentului PCR, ar trebui investigată în acest caz particular.
RT-PCR este un instrument puternic pentru a evalua expresia genelor. Această caracteristică poate explica parțial variabilitatea expresiei genei gp91-phox în rândul pacienților incluși în acest studiu și importanța combinării perechilor suprapuse de primeri pentru a examina întreaga lungime a mesajului. RT-PCR a fost utilizat în studii de caz izolate ca parte a diagnosticului inițial al diferitelor forme de CGD (17-22). Analiza RT-PCR a fost utilă și în diagnosticul prenatal al CGD, rezultat din deficitul de P47-phox (23). Cu toate acestea, a fost mai frecvent utilizat pentru studiul reglării genetice a componentelor NADPH-oxidazei într-o varietate de celule (15,16,24-29). Până în prezent, utilizarea potențială a acestui instrument util pentru stabilirea diagnosticului definitiv al CGD legat de X, cea mai frecventă formă, nu a fost investigată pe larg. Ar trebui efectuate studii suplimentare pentru a compara sensibilitatea și specificitatea acestui test în comparație cu alte teste complexe, cum ar fi bloturile occidentale sau nordice.
în general, am demonstrat că RT-PCR, o metodologie simplă și cu costuri reduse, a stabilit diagnosticul definitiv al CGD legat de X în 7 din 8 cazuri, fără a fi nevoie să se utilizeze metodologii complexe și costisitoare, cum ar fi Northern blot, slot blot, analiza SSCP sau secvențierea ADN-ului genomic. Astfel, RT-PCR poate fi un instrument adecvat pentru diagnosticarea CGD în laboratoarele din țările în curs de dezvoltare. Este foarte important să se determine defectul genetic molecular definitiv pentru a oferi consilierea genetică adecvată și prognosticul pentru rudele cu CGD. În plus, studiile genetice moleculare ale sistemului uman NADPH-oxidază vor avansa cunoștințele despre acest mecanism de apărare crucial și antic.
2. Aterizare BH & Shirkey HS (1957). Un sindrom de infecție recurentă și infiltrarea viscerelor prin histiocite lipidice pigmentate. Pediatrie, 20: 431-442.
3. Patterson EL, Milstrey R & Stokstad ELR (1975). Efectul seleniului în prevenirea diatezei exudative la pui. Lucrările Societății pentru Biologie Experimentală și Medicină, 95: 617-620.
5. Forrest CB, Forehand JR, Axtell RA, Roberts RL & Johnston Jr RB (1988). Caracteristici clinice și managementul actual al bolii granulomatoase cronice. Clinici de Hematologie / Oncologie din America de Nord, 2: 253-266.
6. Curnutte JT (1993). Boala granulomatoasă cronică: rezolvarea unei ghicitori clinice la nivel molecular. Imunologie clinică și imunopatologie, 67: S2-S15.
7. Dinauer MC, Orkin SH, Brown R ,Jesaitis AJ & Parkos CA (1987). Glicoproteina codificată de locusul bolii granulomatoase cronice legate de X este o componentă a complexului citocromului neutrofil B. Natură, 327: 717-720.
9. Clark RA, Malech HL, Gallin JI, Nunoi H, Volpp BD, Pearson DW, Nauseef WM & Curnutte JT (1989). Variante genetice ale bolii granulomatoase cronice: prevalența deficiențelor a două componente citosolice ale sistemului NADPH oxidază. Jurnalul de Medicină din New England, 321: 647-652.
10. Cruce ar, Noack D, Rae J, Curnutte JT & Heyworth PG (2000). Mutații hematologice importante: formele autozomale recesive ale bolii granulomatoase cronice (prima actualizare). Celule sanguine, molecule și boli, 26: 561-565.
11. Smith RM & Curnutte JT (1991). Baza moleculară a bolii granulomatoase cronice. Sânge, 77: 673-686.
12. Vowells SJ, Fleisher TA, Sekhsaria S, Alling DW, Maguire TE & Malech HL (1996). Variabilitatea dependentă de genotip în evaluarea citometrică în flux a funcției reduse a nicotinamidei adenin dinucleotid fosfat oxidazei la pacienții cu boală granulomatoasă cronică. Jurnalul de Pediatrie, 128: 104-107.
15. Condino-Neto a & Newburger PE (1998). Activitatea oxidazei NADPH și conținutul citocromului b558 al limfocitelor B transformate de virusul Epstein-Barr uman se corelează cu expresia genelor care codifică componentele sistemului oxidazei. Arhive de Biochimie și Biofizică, 360: 158-164.
16. Condino-Neto a & Newburger PE (2000). Interferon-gamma îmbunătățește eficiența de îmbinare a transcrierilor genei CYBB într-o variantă receptivă la interferon a bolii granulomatoase cronice legate de X datorită unei mutații a regiunii consensului site-ului de îmbinare. Sânge, 95: 3548-3554.
19. Bonizzato A, Russo MP, Donini M & Dusi S (1997). Identificarea unei mutații duble (D160V-K161E) în gena p67phox a unui pacient cu boală granulomatoasă cronică. Comunicări de cercetare biochimică și Biofizică, 231: 861-863.
21. Noack D, Heyworth PG, Newburger pe & cruce ar (2001). O mutație intronică neobișnuită în gena CYBB care dă naștere bolii granulomatoase cronice. Biochimica și Biofizica Acta, 1537: 125-131.
22. Roesler J, Curnutte JT, Rae J, Barrett D, Patino P, Chanock SJ & Goerlach A (2000). Evenimentele de recombinare dintre gena p47-phox și pseudogenele sale foarte omoloage sunt principala cauză a bolii granulomatoase cronice autozomale recesive. Sânge, 95: 2150-2156.
23. De Boer M, Singh V, Dekker J, Di Rocco M, Goldblatt D & Roos D (2002). Diagnostic Prenatal în două familii cu boală granulomatoasă cronică autozomală, cu deficit de p47(phox) datorită unei mutații punctuale noi în NCF1. Diagnosticul Prenatal, 22: 235-240.
24. Baehner RL, Millar-Groff s & Bringas P (1999). Expresia de dezvoltare a componentelor oxidazei fagocitare NADPH în embrionii de șoarece. Cercetare Pediatrică, 46: 152-157.
25. Banerjee R, Anguita J, Roos D & Fikrig E (2000). Margine de tăiere: infecția cu agentul ehrlichiozei granulocitare umane previne explozia respiratorie prin reglarea în jos a gp91phox. Jurnalul de Imunologie, 164: 3946-3949.
26. Bayraktutan U, Blayney L & Shah AM (2000). Caracterizarea moleculară și localizarea componentelor nad (P)H oxidază gp91-phox și p22-phox în celulele endoteliale. Arterioscleroza, tromboza și biologia vasculară, 20: 1903-1911.
27. Cobbs S, Malech HL, Leto TL, Freeman SM, Blaese RM, Gallin JI & Lomax KJ (1992). Expresia retrovirală a proteinei p47phox recombinante de către limfocitele B transformate de virusul Epstein-Barr de la un pacient cu boală granulomatoasă cronică autozomală. Sânge, 79: 1829-1835.
28. Gorlach A, Brandes RP, Nguyen K, Amidi M, Dehghani F & Busse R (2000). Un gp91phox care conține NADPH oxidază exprimată selectiv în celulele endoteliale este o sursă majoră de generare a radicalilor de oxigen în peretele arterial. Cercetarea Circulației, 87: 26-32.
29. Rouzaut A, Lopez-Moratalla N & de Miguel C (2000). Expresia genică diferențială în activarea și maturarea monocitelor umane. Arhive de Biochimie și Biofizică, 374: 153-160.
31. Ochs HD & Igo RP (1973). Testul de diapozitive NBT: o metodă simplă de screening pentru detectarea bolii granulomatoase cronice și a purtătorilor de sex feminin. Jurnalul de Pediatrie, 83: 77-82.
32. Boyum A (1968). Izolarea celulelor mononucleare și a granulocitelor din sângele uman. Jurnalul Scandinav de Investigații Clinice și de laborator, 21 (supliment 97): 1-77.
33. Condino-Neto A, Muscara MN, Grumach AS, Carneiro-Sampaio MMS & de Nucci G (1993). Neutrofilele și celulele mononucleare de la pacienții cu boală granulomatoasă cronică eliberează oxid nitric. Jurnalul britanic de Farmacologie Clinică, 35: 485-490.
35. Condino-Neto A, Muscara MN, Grumach AS, Bellinati-Pires R, Brandao AC, Carneiro-Sampaio MMS & de Nucci G (1996). Efectul terapiei cu interferon-gamma uman recombinant asupra eliberării de oxid nitric cu celule neutrofile și mononucleare de la pacienții cu boală granulomatoasă cronică. Jurnalul de cercetare a interferonului și citokinelor, 16: 357-364.
36. Volkman DJ, Buescher ES, Gallin JI & Fauci AS (1984). Liniile celulare B ca modele pentru bolile fagocitare moștenite: generarea de superoxid în boala granulomatoasă cronică și granule în sindromul Chediak-Higashi. Jurnalul de Imunologie, 133: 3006-3009.
37. Nilsson K, Klein G, Henle W & Henle G (1971). Stabilirea liniilor celulare limfoblastoide din țesutul limfoid uman adult și fetal și dependența acestuia de EBV. Jurnalul Internațional de Cancer, 8: 443-450.
39. Subrahmanyam YVBK, Baskaran N, Newburger pe & Weissman SM (1999). O metodă modificată pentru afișarea fragmentelor 3′-end restricton ale ADNc: profilarea moleculară a expresiei genelor în neutrofile. Metode în enzimologie, 303: 272-297.
mulțumiri
autorii mulțumesc pacienților și familiilor lor pentru participare și pentru ajutor și asistentei Silvana Severino pentru asistență tehnică. Autorii îi mulțumesc, de asemenea, prof.Peter Newburger, Universitatea din Massachusetts Medical School, pentru o revizuire critică a acestui manuscris.
corespondență și note de subsol