Braz J Med Biol Res, de Maio de 2004, Volume 37(5) 625-634
A utilização de transcrição reversa-PCR para o diagnóstico de X-linked crônica, doença granulomatosa
P. Agudelo-Flórez1, J. A. López1, J. Redher1, M. M. S. Carneiro-Sampaio2, B. T. Costa-Carvalho3, A. S. Grumach4 e A. Condino-Neto1
1Centro de Investigação em Pediatria e Departamentos de Pediatria e Farmacologia, Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP, Brasil
2Departamento de Imunologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil
3Disciplina de Alergia, Imunologia e Reumatologia, Departamento de Pediatria, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil
4Laboratório de Investigação Médica 56, Departamento de Dermatologia, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil
Resumo Introdução Pacientes e Métodos Resultados Discussão Agradecimentos Correspondência e notas de Rodapé
Resumo 
doença granulomatosa Crônica (CGD) é uma doença hereditária do sistema imunitário inato, caracterizada por um defeito do burst oxidativo dos fagócitos e posterior comprometimento de sua atividade microbicida. As mutações num dos componentes da NADPH-oxidase afectam a expressão ou a função do gene deste sistema, conduzindo ao fenótipo do CGD. Defeitos no phox gp91 conduzem a CGD com ligações X, responsável por aproximadamente 70% dos casos CGD. A investigação do genótipo altamente heterogéneo dos doentes com CGD inclui análises de mutação, ensaios de manchas do Norte ou do oeste, de acordo com o caso específico. O objetivo do presente estudo foi o uso da transcrição reversa (RT)-PCR para a análise de defeitos moleculares responsáveis por CGD de ligação X em oito pacientes brasileiros e para avaliar o seu potencial para uma aplicação mais ampla ao rastreio molecular em CGD. O ARN Total foi preparado a partir de linfócitos B transformados pelo vírus de Epstein B e transcritos reversos utilizando hexâmeros aleatórios. O cDNA resultante foi amplificado por pares específicos e sobrepostos de iniciadores projetados para amplificar três regiões do gene gp91-Fox: exons 1-5, 3-9 e 7-13. Esta estratégia detectou uma expressão gp91-Fox defeituosa em sete doentes. Os resultados da RT-PCR correspondem à história clínica, aos dados bioquímicos (nitroblue tetrazólio ou teste de libertação de superóxido) e à análise de mutação disponível em quatro casos. Em três casos adicionais, os resultados da RT-PCR coincidiram com a história clínica e os dados bioquímicos. Em outro caso, a RT-PCR foi normal apesar de uma história clínica compatível com CGD e ruptura respiratória defeituosa. Concluímos que esta nova aplicação da análise RT-PCR – um método simples, econômico e rápido – foi apropriada para o rastreio de defeitos moleculares em 7 de 8 pacientes com acoplamentos X CGD.
palavras-Chave: Superóxido, Fagócitos, imunodeficiência Primária, Respiratory burst, Neutrófilos Humanos
Introdução
doença granulomatosa Crônica (CGD) é uma imunodeficiência primária descrita originalmente em 1957 como uma entidade clínica que afetam crianças do sexo masculino e nomeado, no momento fatal, doença granulomatosa da infância. As principais características do CGD são infecções recorrentes e graves envolvendo as barreiras naturais do organismo, tais como o trato respiratório e gânglios linfáticos, e, eventualmente, estruturas internas, tais como o fígado, baço, ossos e cérebro (1-3). A incidência estimada desta doença rara é de 1 250 000 nados-vivos por ano. As infecções são geralmente causadas por bactérias catalase-negativas tais como Staphylococcus aureus, bacilos Gram-negativos e Espécies fúngicas tais como Aspergillus, Candida e Nocardia (4,5).
o sistema NADPH-oxidase gera superóxido e outros intermediários reativos de oxigénio, cruciais para a actividade microbicida dos fagócitos. O defeito bioquímico no CGD é uma diminuição da actividade da NADPH-oxidase e subsequente incapacidade de destruir microrganismos (6). Os principais componentes do sistema NADPH-oxidase são gp91-, p22-, p47-, p67-, e p40-Fox. Os defeitos moleculares que causam o CGD são geralmente devidos à ausência, baixa expressão ou mau funcionamento de um dos componentes da NADPH-oxidase. A forma X-ligada desta doença é causada por defeitos na gp91-Fox, a cadeia pesada do citocromo b588, e é responsável por aproximadamente 70% de todos os casos (7,8). As formas autossómicas recessivas são causados por defeitos em um dos cytosolic componentes da NADPH oxidase (p47 – ou p67-phox, respectivamente em 20% e 5% dos casos), ou o citocromo b588 luz componente da cadeia (p22-phox, em 5% dos casos) (9,10). A CGD é uma condição altamente heterogénea: mais de 300 mutações foram registadas numa base de dados X-CGD mantida internacionalmente (8). As mutações foram distribuídas em grande parte dentro dos 13 exons ou nos limites exon/intron do gene gp91-Fox (CYBB) e quase 200 dessas mutações são únicas.
o diagnóstico de CGD baseia-se geralmente nas características clínicas da doença e na actividade deficiente da NADPH-oxidase, como demonstrado por testes anormais de nitroblue tetrazólio (NBT), di-hidrorodamina 123, ou testes de libertação de superóxido (11,12). No teste estimulado NBT, indivíduos normais exibem quase 100% de células positivas, enquanto em pacientes com CGD menos de 5% das células são positivas (13). Além disso, as células de doentes com variante CGD são positivas, mas apresentam apenas uma actividade muito baixa (6). O teste NBT também detecta os portadores de CGD (mães e irmãs). É estabelecido um diagnóstico molecular definitivo do CGD em doentes com um teste NBT anormal ou com uma actividade de ruptura respiratória com uma das seguintes características: mutação em gp91-, p22-, p47-ou p67-Fox; ausência de mRNA para um destes genes detectado pela análise da mancha Setentrional; e/ou ausência de proteína para um destes componentes da oxidase pela mancha Ocidental. Um diagnóstico genético, mas não molecular, pode ser estabelecido por demonstração de primos maternos, tios ou sobrinhos com um teste NBT anormal ou ruptura respiratória (14). Assim, o estabelecimento de um diagnóstico definitivo desta rara e altamente heterogênea doença requer complexo e caro, metodologias, tais como uma combinação de Northern blot ou Western blot, e single-strand polimorfismo de conformação de análise (SSCP), seguido de sequenciamento de DNA de vários membros da família, todos realizados em alta complexidade, de laboratórios de pesquisa.
the reverse transcription-PCR (RT-PCR) method involves the amplification of cDNA by PCR. Esta técnica pode ser facilmente padronizada em laboratórios menos sofisticados. Fornece informações sobre a expressão genética e dados preliminares sobre a estrutura ou o tamanho do ARNm do componente defeituoso. RT-PCR raramente foi usado na pesquisa CGD, sendo limitado a estudos de fisiopatologia (15-29). Até à data, o potencial uso desta útil ferramenta para estabelecer o diagnóstico definitivo do CGD ligado a X, a forma mais frequente, Não foi extensivamente investigado. O objetivo do presente estudo foi avaliar a utilização de RT-PCR para o rastreio de defeitos moleculares responsáveis pela CGD associada a X, uma imunodeficiência rara e possivelmente mal diagnosticada, em oito pacientes brasileiros.
doentes e métodos
doentes
o estudo incluiu 8 doentes brasileiros não relacionados com o sexo masculino com provável CGD relacionada com o X (2 negros e 6 caucasianos; idade 2-8 anos; Altura 88-108 cm; Peso 11-19 kg). Os doentes apresentaram histórias clínicas de infecções graves recorrentes, tais como pneumonia, linfadenite, abcesso hepático, piodermite e reacções adversas à imunização por BCG. Foram encaminhados para o nosso laboratório de avaliação bioquímica e de diagnóstico molecular. Foi obtido consentimento informado por escrito dos participantes antes do estudo. O Comitê de Ética da Escola Médica aprovou o protocolo de acordo com a Convenção de Helsinque e a Resolução 196/96 do Ministério da saúde do Brasil.
diagnóstico bioquímico de CGD
o diagnóstico bioquímico de CGD foi estabelecido de acordo com os critérios de imunodeficiência do Grupo Pan-Americano. Foi demonstrada uma diminuição da actividade da NADPH-oxidase através do teste de deslizamento NBT e/ou do teste de libertação de aniões superóxido por neutrófilos do sangue periférico e leucócitos mononucleares (14,30,31). Os neutrófilos e os leucócitos mononucleares foram obtidos por centrifugação de amostras de sangue num gradiente de densidade Ficoll-Hipaco (32).
o teste de deslizamento NBT baseou-se na redução de NBT para formazano por leucócitos activados (31). O ensaio foi realizado como descrito anteriormente (30). Mais de 95% dos 200 neutrófilos normais estimulados com 12-miristato de 30 nM de phorbol 13-acetato (PMA) devem ser capazes de reduzir a NBT. A ausência de reacção ou células <5% positivas foi considerada como indicando um diagnóstico de CGD (14).A libertação quantitativa de superóxido
por neutrófilos e leucócitos mononucleares foi avaliada por um ensaio de redução do citocromo c inibível pela superóxido modificado (33-35). A quantidade de superóxido libertado foi calculada utilizando um coeficiente de extinção de 0,21 nM/cm para o citocromo C. os resultados são apresentados como superóxido nmol libertado por 106 células por hora. Os doentes com CGD mostraram menos de 10% dos valores de controlo.
Triagem de defeitos moleculares responsáveis pela X-linked CGD
linfócitos B de X-linked CGD pacientes foram transformados in vitro com Epstein B vírus (EBV) (15,16), a fim de fornecer uma abundante fonte de ácidos nucléicos para estudos moleculares. As linhas de células B transformadas pelo EBV reproduzem os defeitos bioquímicos e moleculares dos pacientes com CGD (15,16,36), e eliminam a necessidade de recolhas repetidas de sangue. Brevemente, leucócitos do sangue periférico de X-linked CGD pacientes foram cultivadas com sobrenadante de B95-8, uma EBV-produtor da linha celular (15,16,36,37), em RPMI 1640 meio suplementado com inactivadas pelo calor de soro bovino fetal (10%), 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina e 100 µg/ml de estreptomicina, a 37ºC, em atmosfera úmida com 5% de CO2. A viabilidade celular foi monitorizada e as culturas foram mantidas ao longo do período de estudo.
amostras de ARN de linhagens B transformadas em EBV foram preparadas pelo método de guanidina HCl, seguido de precipitação de etanol e quantificação por métodos padrão (38,39). As amostras de cDNA foram obtidas por transcrição reversa de 2 µg de RNA total com superscript II RT (GIBCO BRL) e hexâmeros aleatórios (15). A qualidade das amostras de ARNm foi verificada por amplificação PCR de ß-actina, um controlo genético constitutivo (bp 920-943 e bp 1494-1471) (Gen Bank accession No. NM001101).
a expressão genética gp91-Fox foi avaliada pela RT-PCR. Pares específicos e sobrepostos de iniciadores (Gen Bank accession No. NM_000397, Tabela 1) foram usados para amplificar (30 ciclos) três regiões exônicas gp91-Fox: 1-5, 3-9, e 7-13. Esta estratégia permitiu-nos Visualizar todos os exons gp91-Fox. Os produtos PCR foram analisados por electroforese em gel de agarose a 2% e manchados com brometo de etídio.
a expressão relativa do gene gp91-Fox foi analisada com o software mestre de imagem (Pharmacia-Biotech). O resultado de densitometria para amostras alvo foi dividido pelo resultado de densitometria da ß-actina, um controle genético constitutivo, normalizando o nível considerado para análise. Os resultados dos ensaios RT-PCR foram comparados com a história clínica do doente, os ensaios bioquímicos (NBT e/ou ensaio de libertação de superóxido) e os dados disponíveis da análise de mutação (índicehttp://www.sbi.org.br/Sbi2003/.htm).
resultados
estudámos 8 doentes do sexo masculino com histórias clínicas de infecções graves recorrentes, encaminhados para o nosso laboratório de diagnóstico bioquímico e molecular de CGD. Os resultados dos ensaios de deslizamento NBT e dos ensaios de libertação de superóxido são apresentados no quadro 2. Seis dos doentes apresentaram leucócitos menos de 5% positivos no teste de deslizamento NBT. Seis doentes apresentaram diminuição da libertação de superóxido pelos granulócitos e/ou leucócitos mononucleares (menos de 10% em comparação com os controlos saudáveis). Quatro doentes apresentaram resultados anormais em ambos os testes. Todos os doentes apresentaram pelo menos um teste anómalo e receberam o diagnóstico de CGD provavelmente ligado a X. A mãe e a irmã do paciente T. B. P. apresentaram um teste de slide NBT compatível com o status de portador do CGD ligado a X. Durante o período de estudo, um paciente (M. G.) morreu de pneumonia.
investigamos em seguida o diagnóstico definitivo da CGD ligada a X pela análise RT-PCR da expressão do gene gp91-Fox. Os resultados da amplificação RT-PCR com três conjuntos de iniciadores sobrepostos são apresentados na Tabela 2. A qualidade da amostra de ARNm foi verificada pela amplificação PCR da ß-actina, um controlo genético constitutivo. Os produtos normais esperados foram obtidos neste caso (Figuras 1, 2 e 3).
em quatro casos, foi possível combinar os dados RT-PCR com a análise de mutação disponível, apresentada por Patiño et al. (30) ou pelo nosso grupo (//www.sbi.org.br/Sbi2003/index.htm): J. E. M. apresentou uma transição C469®T em exon 5, prevendo uma mutação sem sentido (R157X). M. F. apresentou uma substituição sem sentido em exon 3, R (arginina) 73-Stop. R. S. mostrou uma substituição de 264 G®A na junção de 3 ‘ de gp91-phox exon 3. A sequência cDNA mostrou uma eliminação do exon 3 gp91-Fox, dando origem a um mutante instável ou não funcional gp91-Fox. G. G. apresentou um splicing defeituoso do exon 3 gp91-Fox (a mutação subjacente ainda não foi determinada). Os outros pacientes continuam sob investigação.
no seu conjunto, esta estratégia permitiu a detecção da expressão defeituosa de gp91-Fox em Sete de oito doentes. Os resultados da RT-PCR correspondem à história clínica, aos dados bioquímicos (NBT ou ensaio de libertação de superóxido) e à análise de mutação disponível em quatro casos. Em três casos adicionais, os resultados da RT-PCR coincidiram com a história clínica e os dados bioquímicos. Em outro caso, a RT-PCR foi normal apesar de uma história clínica compatível com a CGD, uma ruptura respiratória defeituosa caracterizada pelo teste NBT e teste de libertação de superóxido e testes NBT de sua mãe e irmã compatíveis com o estado de suporte de CGD associado a X.
discussão
este artigo relata os estudos de expressão bioquímica e genética de 8 pacientes brasileiros não relacionados com a história clínica de CGD, que foram encaminhados para o nosso laboratório para investigação detalhada. CGD é uma doença hereditária rara na qual as células fagocíticas são incapazes de gerar anião superóxido e outros intermediários reativos de oxigênio. Inicialmente estabelecemos o diagnóstico do provável CGD ligado a X através de métodos bioquímicos, tais como os testes de deslizamento NBT e/ou testes de libertação de aniões superóxido. Os nossos resultados mostraram que todos os doentes apresentavam uma função diminuída da NADPH-oxidase e, por sua vez, um provável CGD ligado ao X.
ambos os métodos contribuem para o diagnóstico provável de CGD de maneiras diferentes. O teste de slide NBT fornece informações sobre o número de células que reduzem NBT a formazano dentro do citoplasma e a intensidade desta redução. Assim, pacientes com formas variantes de CGD X-linked mostram testes de slide NBT anormais, em que a maioria das células reduz a NBT fracamente para formazan. O teste de slide NBT também detecta portadoras femininas de CGD com X-linked. O ensaio de libertação de superóxido mede a redução do citocromo c pelo superóxido produzido pelos leucócitos activados presentes na reacção, permitindo o diagnóstico de formas variantes do CGD associado a X. Ambos os testes podem ser facilmente padronizados em laboratórios de baixa complexidade e nenhum requer equipamentos caros. O teste de di-hidrorhodamina 123 é um método altamente sensível para o diagnóstico bioquímico de CGD; no entanto, ele requer um citômetro de fluxo, um instrumento muito caro.Avaliámos a expressão do gene gp91-Fox em linfócitos B transformados em EBV a partir de doentes com CGD por análise RT-PCR . Pares específicos e sobrepostos de iniciadores foram usados para amplificar três regiões do gene gp91-Fox por RT-PCR: exons 1-5, 3-9, e 7-13. Esta estratégia permitiu a detecção de uma expressão gp91-Fox defeituosa em 7 de 8 doentes. Os resultados da RT-PCR correspondem à história clínica, aos dados bioquímicos (NBT ou ensaio de libertação de superóxido) e à análise de mutação disponível em quatro casos. Em três casos adicionais, os resultados da RT-PCR coincidiram com a história clínica e os dados bioquímicos.
a expressão do gene gp91-Fox foi reduzida em todas as regiões exónicas do doente R. B. esta redução pode ser o resultado de mutações que conduzem a uma baixa estabilidade do ARN ou a uma actividade transcripcional alterada. Pacientes G. M. e T. P. mostrou ausência de expressão de exons 7-13, sugerindo que a diminuição da expressão destes exons adicionais de 3′-end pode ser o resultado de instabilidade de RNA ou um defeito de splicing, por exemplo, splicing parcialmente correto para produzir um sinal, mas splicing parcialmente anormal para eliminar um local de ligação primer, um sujeito a ser investigado por futuras análises de mutação do DNA genômico.
paciente G. G. apresentou um produto difuso, de baixa abundância, de tamanho menor de exons 1-5 (Figura 1), e ausência de expressão de outras regiões exônicas. A análise de mutação mostrou um defeito no local de fusão exon 3. Da mesma forma, a análise de mutação do paciente R. S. também revelou um defeito no local da unidade exon 3. No entanto, neste caso, um produto PCR menos abundante poderia ser detectado.
o doente M. F. apresentou uma expressão reduzida das regiões exónicas 3-9 e 7-13, que pode ser o resultado de uma actividade transcritional defeituosa no exon 3. J. E. M. apresentou uma mutação sem sentido em exon 5 que resultou na perda da expressão gp91-Fox, como evidenciado pela análise RT-PCR, uma possível consequência da instabilidade de mRNA mediada por disparates.
em um caso, paciente T. P. B. a expressão do gene gp91-Fox era normal apesar de um histórico familiar compatível com CGD e uma atividade respiratória defeituosa. Neste caso, o diagnóstico do provável CGD ligado a X foi baseado em testes NBT anormais em sua mãe e sua irmã, compatível com o status de transportador. A hipótese é que uma mutação de ponto, como uma substituição de base única que não altera o comprimento do fragmento de PCR ou a abundância, deve ser investigada neste caso particular.
RT-PCR é uma ferramenta poderosa para avaliar a expressão genética. Esta característica pode explicar parcialmente a variabilidade da expressão do gene gp91-FOX entre os pacientes incluídos neste estudo, e a importância de combinar pares sobrepostos de iniciadores para visualizar o comprimento total da mensagem. A RT-PCR tem sido utilizada em estudos de casos isolados como parte do diagnóstico inicial das diferentes formas de CGD (17-22). A análise RT-PCR também foi útil no diagnóstico pré-natal de CGD, resultante da deficiência de P47-Fox (23). No entanto, tem sido mais comumente usado para o estudo da regulação genética dos componentes da NADPH-oxidase em uma variedade de células (15,16,24-29). Até à data, o potencial uso desta útil ferramenta para estabelecer o diagnóstico definitivo do CGD ligado a X, a forma mais frequente, Não foi investigado extensivamente. Devem ser realizados outros estudos para comparar a sensibilidade e especificidade deste teste em comparação com outros ensaios complexos, tais como blots ocidentais ou Setentrionais.
no geral, temos demonstrado que a RT-PCR, uma metodologia simples e de baixo custo, estabeleceu o diagnóstico definitivo de CGD X-linked em 7 de 8 casos, sem a necessidade de usar metodologias complexas e caras como Northern blot, slot blot, análise SSCP, ou sequenciação genômica do DNA. Assim, RT-PCR pode ser uma ferramenta adequada para diagnosticar CGD em laboratórios nos países em desenvolvimento. É muito importante determinar o defeito genético molecular definitivo, a fim de fornecer o aconselhamento genético apropriado e prognóstico às famílias com CGD. Além disso, estudos genéticos moleculares do sistema da NADPH-oxidase humana avançarão o conhecimento sobre este mecanismo de defesa crucial e antigo.
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agradecimentos
os autores agradecem aos doentes e às suas famílias pela sua participação e pela sua ajuda, e a enfermeira Silvana Severino pela Assistência Técnica. Os autores também agradecem ao Prof. Peter Newburger, da Universidade de Massachusetts Medical School, por uma revisão crítica deste manuscrito.
correspondência e notas