PMC

HCV RNA kvantifikace.

cílem této studie bylo vyvinout jednoduchý, real-time zásahovou jednotku-PCR pro kvantifikaci HCV RNA v obou sérum a vzorky jater s SYBR Green I detekce spíše než použití značených sond. Real-time zásahovou jednotku-PCR testy byly provedeny s LightCycler (Roche) s oběma single-round zesílení a román omezený cyklu vnořené zesílení. RNA standardy byly přepsány s T7 polymerázy z amplikony získané od 5′ untranslated region PCR produkty zaklonované do pGEM-T Easy (Promega) a léčených dvakrát s RQ1 Dnázy. RNA byla kvantifikována spektrofotometrií. Pro jednokolovou kvantifikaci vzorků séra byla RNA reverzní transkribována, jak bylo popsáno výše (7). Pro kvantifikaci vnořené PCR s omezeným cyklem byla provedena RT-PCR v jednostupňové reakci s 15 cykly PCR (krok s omezeným cyklem), následovaný QRT-PCR v reálném čase. HCV zatížení byla měřena pomocí real-time PCR s vnější primery KY78 a KY80 pro jedno kolo reakce (21) nebo vnější primery plus vnitřní primery hep21b a hep22 pro omezený cyklu vnořené reakce (19). Reakční směsi zahrnovaly 2 µl Fast Start DNA Master SYBR Green I (Roche), 4 mM MgCl2, koncentraci 0,5 µM každého primeru a 2 µl šablony v celkovém objemu 20 µl. Po inkubaci 10 min při 95°C, LightCycler PCR byla prováděna po dobu 40 cyklů, každý cyklus skládající se z 15 s při 95°C, žíhání při teplotě 60°C po dobu 5 s a extenze při 72°C po dobu 10 sekund. Fluorescence byla sledována při 530 nm a specificita signálu byla kontrolována analýzou tavící křivky.

syntetické HCV RNA jako šablony, citlivost na jedno kolo v reálném čase zásahovou jednotku-PCR byla přibližně 103 HCV kopií/reakci nebo 5 × 104 kopií/ml, je-li ředicí faktor byl vypočítán. Byl pozorován široký lineární vztah (až 6,5 × 108 kopií / reakce) mezi počtem PCR cyklů potřebných k detekci fluorescenčního signálu a počtem kopií HCV. Měřili jsme sérové virové zátěže z 24 pacientů chronicky infikovaných různých genotypů HCV převládající v Austrálii (1a, 1b, 2a, 2b, 2c a 3a) (6). Tři pacientů virovou zátěž pod citlivosti této verze testu (5 × 104 kopií/ml), i když byly pozitivní kvalitativní in-house nested RT-PCR assay (19). Zbývajících 21 pacientů mělo virovou zátěž v rozmezí od 2,8 × 105 do 9,1 × 106 kopií / ml. Pro zvýšení citlivosti a specificity testu, 15-cyklus, one-step RT-PCR byla zavedena s následnou kvantitativní PCR v reálném čase pro druhé kolo. U syntetické RNA byla modifikovaná metoda schopna detekovat širokou škálu čísel kopií HCV (od 28 do 2,8 × 106 kopií HCV / reakce) při zachování linearity. Citlivost omezena cyklu vnořené zásahovou jednotku-PCR byla větší než 28 kopií/reakci (nebo 1400 kopií/ml), což je přibližně 40-krát větší než na jedno kolo zásahovou jednotku-PCR. Citlivost tohoto testu je srovnatelná s těmi již bylo dříve oznámeno pomocí metody real-time kvantifikaci s TaqMan technologií (Roche) a ABI Prism 7700 sequence detection system (Perkin-Elmer), které vykazují citlivost 10 kopií/reakci (9, 16) a 1 000 kopií/reakci (12). Citlivost detekce Světlocykleru (Roche) a SYBR Green I byla také hlášena jako 10 kopií / reakce (10). Pro další ověření této verze testu byly virové zátěže 16 vzorků séra pozitivních na HCV, které se pohybovaly od 1 × 103 do 1.2 × 106 kopií/ml (stanoveno s Amplicor Monitor test), bylo prokázáno, že úzce korelují s výsledky získanými s nested real-time zásahovou jednotku-PCR (r= 0.876, P < 0.0001, n = 16) (Obr. (Obr.11).

HCV se replikuje v játrech, ale jen málo studií se pokusili vztahují virové zátěže v játrech na klinické výsledky, raději zkoumat prediktivní hodnota sérového virové zátěže. Ta by mohla být považována za vhodnou náhradu pro jaterní virové zátěže, pokud by se ukázalo, že korelují, ale jen málo studií to ukázalo a výsledky, které byly dosud hlášeny, nejsou přesvědčivé. Test QRT-PCR s omezeným cyklem byl proto použit k měření zátěže jaterních HCV. Množství jaterní tkáně použité pro analýzu vážilo mezi 0, 8 a 8, 1 mg (průměr = 3.88 ± 2,1 mg), z nichž bylo extrahováno 2,1 až 12,9 µg (průměr = 6,62 ± 3,1 µg) RNA. Výnos celkové RNA v průměru 1.71 × 103 µg/g jaterní tkáně, což je hodnota podobná té předchozí studie 1.01 × 103 µg RNA/g (13). Jaterní virové zátěže v rozmezí od 3.0 × 102 až 1,3 × 106 HCV RNA molekul/µg celkové RNA, a průměr byl 2.38 × 105 ± 3.55 × 105 kopií/µg RNA. Korelace byla prokázána mezi jaterní virové zatížení, měřeno v počtu kopií HCV na mikrogram celkové RNA, a sérum virové zátěže měří s Amplicor Monitor testu, i když to byla slabá (r = 0.417, n = 20) (13). Jiné studie ukázaly, že zatížení HCV RNA v séru se v podstatě odráží množstvím viru v játrech bez poskytnutí korelačních koeficientů (3, 8). Zde uvádíme poprvé statisticky významnou korelaci mezi měřením virové zátěže jater a séra (r = 0, 689, P = 0.004, n = 15), což naznačuje, že hladina virémie ve skutečnosti odráží množství viru přítomného v játrech (obr. (Obr.22).

V předchozích studiích, jater virové zátěže měření byly vyjádřeny jako počet kopií na mg jaterní tkáně, nebo počet kopií na mikrogram celkové RNA. V této studii jsme se ukázat, že buď jednotka se zdá být vhodná, neboť existuje významná korelace mezi virovou zátěž měří v počtu kopií na mg jaterní tkáně, a ty, měřená jako počet kopií na mikrogram celkové RNA (r = 0.937, P < 0.0001, n = 20) (Obr. (Obr.3).3). Tyto výsledky jsou v souladu s výsledky De Moliner et al. (3), kteří rovněž prokázána úzká souvislost mezi virovou zátěž v játrech, vyjádřená jako počet kopií na gram tkáně, a počet kopií na mikrogram celkové buněčné RNA (r = 0.85) (3). Průměrný počet HCV RNA molekul za gram jaterní tkáně byla 2,1 × 108 ± 3.71 × 108, kolem 170-krát vyšší než RNA v séru (1.22 × 106 ± 2.0 × 106 kopií/ml). Toto zjištění je podobné nálezu Terrault et al. (18), who ukázala, že poměr HCV RNA v játrech k poměru v séru byl 103:1. Naproti tomu McGuiness a kol. (13) bylo zjištěno, že hladina v jaterní tkáni byla vyšší o faktor >104. Tento rozdíl se může vztahovat k tomu, že jaterní virové zátěže pacientů v předchozí studii, kteří převážně měli pokročilé infekce HCV, bylo přibližně osmkrát vyšší (1.83 × 106 ± 0.75 × 106 kopií/µg RNA), než ty zaznamenané v této studii (2.38 × 105 ± 3.55 × 105 kopií/µg RNA).

Závěrem lze říci, že test QRT-PCR v reálném čase je citlivou, přesnou a spolehlivou metodou pro sledování zátěže HCV ve vzorcích séra i jater.