izolarea și extinderea pe termen lung a celulelor primare, în special a populațiilor stem/progenitoare, sunt tehnici de bază fundamentale și importante în diverse domenii biologice, inclusiv biologia dezvoltării și biologia celulelor stem și știința medicală. Celulele din țesuturile epiteliale stratificate și coloane sunt foarte regenerative și disproporționat responsabile pentru multe tipuri de cancer uman; cu toate acestea, clonarea celulelor stem adulte este limitată de dificultățile de menținere a acestor celule într-o stare imatură. În ultimii ani, inovațiile tehnice au dus la progrese rapide și dramatice în biologia celulelor stem, cum ar fi utilizarea moleculelor mici și a factorilor de creștere pentru a imita mediile de nișă tisulară și pentru a facilita „cultura Organoidă” .
în 1975, Rheinwald și Green au stabilit primul exemplu de succes al culturii de celule stem adulte umane folosind keratinocite umane . Mai exact, au menținut keratinocitele umane pe termen lung în combinație cu o linie celulară de fibroblaste de șoarece iradiată subletal, 3T3-J2. Deși nu au folosit termenul ” celule stem „pentru keratinocitele clonate cultivate pe celule 3T3, Green și colegii săi au găsit colonii cu capacitatea remarcabilă de a diviza și de a forma noi colonii după trecere, pe care le-au numit” Holoclone”. Aceste holoclone constau din celule mici, imature, care toate au prezentat o colorare nucleară intensă cu p63, un regulator principal al tulpinii, în celulele epiteliale stratificate . În epiteliul stratificat, incluzând pielea, bronhiile pulmonare, glanda mamară și uroteliul vezicii urinare, populația de celule stem a fost localizată în principal în stratul bazal, iar celulele imature au fost colorate cu p63, în concordanță cu studiile in vitro . În mod semnificativ, keratinocitele umane izolate și extinse din pielea autologă au fost altoite cu succes pentru a arde pacienții și au regenerat o epidermă permanentă asemănătoare cu cea rezultată din grefele de piele cu grosime divizată . În special, aceeași procedură a fost aplicată pentru a izola și extinde celulele epiteliale corneene umane pentru transplant . Deși această tehnologie a fost limitată la celulele stem din epidermă și cornee la acea vreme, Green și colegii săi au creat Fundația pentru clonarea celulelor stem adulte umane în domeniile biologiei de bază și medicinei regenerative.
în acest articol de revizuire, oferim o imagine de ansamblu a progreselor recente ale cercetării și acumularea de dovezi ale unui sistem de cultură celulară care a dus la descoperiri tehnice în tehnologiile celulelor epiteliale. Noile strategii de cultură atât pentru celulele epiteliale stratificate, cât și pentru celulele epiteliale columnare au permis recapitularea dezvoltării epiteliale umane și pot fi utilizate pentru a genera un model de boală umană in vitro. De asemenea, discutăm despre potențialele și posibilele aplicații ale tehnologiilor normale de cultură a celulelor epiteliale pentru medicina regenerativă și evidențiem un sistem de cultură a celulelor canceroase care reproduce fenotipurile individuale ale pacienților.
cultură de celule epiteliale stratificate
în țesuturile epiteliale stratificate, inclusiv epiteliul glandular și pseudostratificat, celulele p63+, care sunt localizate pe membrana bazală, se pot auto-reînnoi pentru a menține populațiile stem/progenitoare și dau naștere la descendenți care formează țesuturi funcționale . După cum sa menționat mai sus, clonarea și extinderea celulelor stem epiteliale, cum ar fi keratinocitele pielii și celulele epiteliale corneene, au fost bine stabilite în sistemele de co-cultură cu fibroblaste iradiate de șoarece 3T3-J2. Cu toate acestea, acest protocol standard a fost în mare parte limitat la cultura pe termen lung a keratinocitelor și a celulelor corneene. Cu toate acestea, au fost raportate celule stem clonate din epiteliile timice, la fel ca și izolarea celulelor stem epiteliale timice din diverse specii, inclusiv celule umane, cultivate cu un sistem de alimentare 3T3 . Mai mult, Frey și colegii au aplicat recent metoda de alimentare 3T3 pentru a izola celulele stem uroteliale care au exprimat Ariciul sonic și au locuit în stratul bazal al uroteliului vezicii urinare . Aceste celule stem uroteliale din țesut uman și porcin izolat au fost cultivate stabil pe un strat de alimentare 3T3 și au putut da naștere la mai multe linii celulare, inclusiv celule bazale p63+ și celule uroplakin 2+ și 3+ uroteliale, după transplantul de capsule renale la șoareci nud. În 2011, Pooja și colab. a exploatat sistemul de cultură 3T3 pentru a izola trei tipuri de celule stem epiteliale ale căilor respiratorii umane, adică., celulele stem ale căilor respiratorii nazale, traheale și distale și a constatat că aceste celule stem epiteliale ale căilor respiratorii au prezentat fenotipuri celulare distincte după diferențierea in vitro, deși clonele de celule stem imature păreau a fi indistinguibile morfologic (Fig. 1) . Într-un studiu de urmărire, transplantul de celule stem epiteliale traheale și distale ale căilor respiratorii de șoarece a demonstrat că celulele stem ale căilor respiratorii distale au fost ușor încorporate în țesutul pulmonar afectat de gripa H1N1 și diferențiate în mai multe tipuri de celule epiteliale, adică., bronhiole și Alveole, în timp ce celulele stem traheale transplantate au fost localizate numai în căile respiratorii majore . Celulele stem clonogene au fost, de asemenea, izolate din probele de biopsie endoscopică a esofagului uman, iar aceste celule au fost capabile să formeze structuri epiteliale scuamoase bine diferențiate, stratificate într-un sistem de cultură air liquid interface (ALI).
schema procesului de cultură celulară pentru celulele stem epiteliale stratificate și columnare umane pe un strat de alimentare de șoarece 3T3. Pentru celulele stem epiteliale stratificate, acestea sunt izolate din biopsie sau probele chirurgicale sunt placate pe un strat 3T3 pentru o cultură pe termen lung. Pentru celulele stem epiteliale columnare, acestea sunt placate pe un strat 3T3 cu factori definiți care sunt esențiali pentru creșterea și întreținerea celulelor stem. Coloniile imature morfologic (colonii ambalate cu celule mici) de celule stem epiteliale sunt preluate mecanic pentru o expansiune omogenă suplimentară. În cultura ALI, celulele suferă diferențiere în tipuri de celule mature într – un Transwell
Schlegel și colegii săi au raportat că un inhibitor al protein kinazei (ROCK) asociat Rho în combinație cu celulele de alimentare 3T3 a crescut semnificativ capacitatea proliferativă a celulelor stem epiteliale, inclusiv keratinocitele umane, celulele prostatei și celulele glandei mamare și au numit acest fenomen „reprogramare condiționată” . Abilitatea de a genera în mod eficient culturi de celule stem epiteliale de la pacienți oferă informații critice și valoroase în diagnosticul și terapia pe bază de celule . Mai recent, Rajagopal și colegii săi au arătat că calea de semnalizare TGF/BMP/SMAD este importantă în diferite țesuturi epiteliale, inclusiv țesutul derivat din ectoderm și țesutul glandei mamare, esofagul derivat din endoderm și țesutul prostatei și epididimul derivat din mezoderm. Ei au descoperit că inhibarea duală a semnalizării SMAD (semnalul BMP a fost blocat de DMH-1, iar semnalul TGF XV a fost inhibat de A-83-01) a facilitat propagarea stabilă a populațiilor de celule bazale epiteliale umane și de șoarece. În mod surprinzător, inhibarea duală a TGF/BMP a permis expansiunea robustă a celulelor stem epiteliale fără a fi nevoie de celule de alimentare 3T3 de șoarece.
în mod colectiv, aceste progrese tehnice, în combinație cu molecule mici și celule de alimentare, pot fi utilizate pentru a extinde continuu și eficient populațiile stem/progenitoare epiteliale stratificate in vitro. O altă descoperire în cultura epitelială stratificată, cultura organoidă, a fost utilizată pentru a extinde atât progenitorii bazali, cât și luminali ai prostatei umane. Acești progenitori luminali umani au fost multipotenți și au format structuri asemănătoare prostatei in vitro . Cu toate acestea, generarea de structuri tridimensionale constând din epitelii stratificate sau pseudostratificate pentru a recapitula arhitectura autentică in vivo rămâne o provocare, deși mulți cercetători au raportat culturi sferoide și organoide. Această problemă poate fi rezolvată prin stabilirea unei metode de facilitare a autoorganizării, așa cum se efectuează în țesuturile derivate din celule stem pluripotente .
cultură de celule epiteliale columnare
deși celulele stem intestinale posedă capacitatea remarcabilă de a prolifera la o rată ridicată de rotație pentru a menține epiteliile intestinale, iar hepatocitele sunt foarte regenerative ca răspuns la daune, capacitatea de a clona populațiile de celule stem din celulele epiteliale columnare este sever limitată, probabil din cauza lipsei semnalelor de nișă tisulară in vitro. În ultimul deceniu, Clevers și colegii au descoperit lgr5 (receptorul cuplat cu proteină g cu conținut de leucină bogat în repetare 5), un marker de celule stem intestinale, într-un model sofisticat de șoarece (șoareci LGR5-EGFP-ires-CreERT2 încrucișați cu reporterul Rosa26 LacZ activat de Cre) și a stabilit o metodă de cultură organoidă intestinală de șoarece care constă din structuri asemănătoare villusului și zone asemănătoare criptelor cu mai multe tipuri de celule intestinale . În combinație cu factori de creștere și cocteiluri cu molecule mici, o fracție izolată de celule stem lgr5+ a fost suspendată în Matrigel și cultivată pe termen lung . Modificând starea de cultură cu utilizarea nicotinamidei, un inhibitor al receptorului P38 și TGF al receptorului de la TGF, celulele epiteliale umane izolate din intestinul subțire și colon au fost capabile să se extindă infinit pe termen lung in vitro . Această tehnică este aplicabilă culturii altor tipuri de celule, cum ar fi celulele canalului pancreatic și hepatocitele , și a facilitat progrese revoluționare în cultura celulelor epiteliale columnare.
cultura Organoidă folosește o platformă de Cultură 3D bazată pe Matrigel și poate fi utilizată pe scară largă pentru a cultiva stabil diverse tipuri de celule epiteliale adulte, inclusiv celule epiteliale stratificate, cu populații de celule stem/progenitoare . Cu toate acestea, capacitatea de a propaga rapid și eficient o fracțiune de celule stem uniforme in vitro este, de asemenea, utilă și importantă pentru studiul detaliat al auto-reînnoirii și specificării soartei în celulele stem tisulare și posibilele aplicații viitoare ale transplantului de celule pentru medicina regenerativă. Xian și colegii săi au dezvoltat recent un nou sistem de cultură pentru extinderea omogenă a celulelor stem intestinale fetale umane, inclusiv a celulelor intestinului subțire și a colonului. Acest sistem a folosit un strat de alimentare de șoarece 3T3 în combinație cu factori de creștere și inhibitori ai căii de semnal pentru a extinde puternic celulele stem epiteliale columnare umane (Fig. 1) . Mai mult, mai mult de 50% din celulele stem intestinale cultivate pe fibroblaste 3T3 au fost capabile să formeze colonii. În intestinul mamiferelor, factorii de nișă definiți, cum ar fi semnalele Wnt și Notch, sunt esențiali pentru guvernarea tulpinii celulelor stem intestinale la baza criptei. Mai mult, celulele Paneth, care sunt, de asemenea, situate la baza criptei, apar din celulele stem și acționează ca nișă de celule stem prin furnizarea de factori esențiali într-o manieră paracrină. Deoarece culturile organoide constau din celule stem și diferiți derivați, cum ar fi celulele Paneth, factorii de nișă sunt furnizați în mod autonom . În schimb, deoarece o populație pură de celule stem intestinale este cultivată pe un strat de alimentare 3T3, celulele nu pot secreta factori de nișă. Prin urmare, factorii extrinseci care seamănă cu factorii de nișă trebuie să fie suplimentați. În plus față de Protocolul de întreținere a celulelor stem, a fost stabilit un protocol de diferențiere într-un model de cultură ALI pentru a da naștere la cel puțin patru tipuri de celule intestinale majore, adică celule Paneth, celule entero-endocrine, celule calice și enterocite (celule absorbante intestinale) . Formarea structurilor asemănătoare vililor intestinali a fost observată în funcție de tipurile de țesuturi originale, cum ar fi țesuturile intestinului subțire și ale colonului (Fig. 1). Într-o abordare diferită a culturii ALI, Kuo și colegii săi au cultivat puternic bucăți mici de intestin neonatal de șoarece cu un element stromal pe termen lung .
aceeași strategie a fost aplicată și pentru clonarea celulelor stem gastrice umane obținute din biopsia endoscopică. Mai exact, celulele gastrice clonogene au fost extinse stabil pe un strat de alimentare 3T3 în combinație cu factori de creștere și molecule mici și diferențiate în linii epiteliale gastrice găsite de obicei în stomac, cum ar fi celulele principale care exprimă pepsinogenul . În plus față de celulele stem ale organelor digestive clonate, celulele progenitoare oviduct din tubul uterului distal au fost, de asemenea, capabile să se propage infinit pe un strat de alimentare 3T3 în prezența factorilor de nișă . Oviductul distal, epiteliul fimbriei, este un strat simplu de epiteliu columnar care constă din următoarele două tipuri de celule: celulele ciliate, care sporesc transportul gameților și celulele secretoare, care secretă mucus. Folosind o ușoară modificare a Protocolului de diferențiere pentru celulele stem intestinale, celulele stem oviductale cultivate pe termen lung au dat naștere unei arhitecturi 3D, care conține atât celule ciliate, cât și celule secretoare, care amintea de structura epiteliului in vivo . Capacitatea de a produce linii epiteliale cu tipuri de celule adecvate dintr-o populație de celule stem ar putea fi un instrument util pentru a studia dezvoltarea epitelială fiziologică și homeostazia și pentru a dezvolta modele de boli acute și cronice in vitro.
cultura celulelor canceroase
deoarece prima linie de celule canceroase, linia de celule HeLa, a fost stabilită de la un pacient cu cancer de col uterin în 1951 , liniile de celule canceroase stabilite dintr-o mare varietate de tipuri de cancer au fost utilizate pe scară largă pentru a studia patobiologia cancerului și au oferit oportunități de a genera modele xenogrefe in vivo și de a testa medicamente anti-cancer in vitro și in vivo. Deși s-au făcut progrese extraordinare în biologia cancerului folosind linii celulare canceroase, rezultatele obținute folosind aceste celule pot să nu reflecte suficient complexitatea bolii așa cum se aștepta inițial, deoarece cancerul prezintă eterogenitate interpacientală și intratumoră, așa cum a relevat progresele recente în secvențierea următoarei generații . Pentru a reflecta mai precis fenotipurile cancerului, inclusiv starea și patologia mutației genetice a pacientului, Welm și colegii săi au dezvoltat modele de xenogrefă (Pdx) derivate din pacient ale cancerului de sân la șoareci cu imunodeficiență combinată severă diabetică nonobeză (NOD-SCID) care au menținut caracteristicile esențiale ale tumorilor originale și au prezentat capacitate metastatică la site-uri specifice . În plus față de modelul cancerului de sân, stabilirea diferitelor tipuri de tumori solide a demonstrat fezabilitatea modelelor PDX , care se anticipează că vor accelera testarea preclinică a noilor terapii de cancer și vor ajuta la realizarea obiectivului „medicinei personalizate”.
metodele de cultură pentru celulele stem adulte, cum ar fi sistemele organoide și de alimentare, sunt, de asemenea, aplicabile diferitelor abordări care utilizează celule canceroase derivate din pacient. Mai exact , Clevers și colegii săi au raportat că cultura organoidă poate fi utilizată pentru a modela pancreasul , prostata și cancerul colorectal și au arătat că trăsăturile originale ale cancerului, inclusiv eterogenitatea genetică și sensibilitatea la medicamente, pot fi recapitulate. Prin urmare, ei au numit acest sistem „Biobank organoid viu”. Aceste tehnologii ar putea fi, de asemenea, utilizate pentru a izola o populație de celule stem de o leziune precanceroasă, cum ar fi esofagul Barrett, un precursor al adenocarcinomului esofagian uman . Celulele stem izolate și extinse ale esofagului Barrett au fost transformate prin introducerea antigenului T mare SV40, hTERT și C-myc și xenografate în șoareci NSG imunocompromiși (NOD.CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ). Așa cum era de așteptat, celulele stem ale esofagului Barrett s-au transformat în tumori asemănătoare adenocarcinomului esofagian la șoareci. O abordare similară a demonstrat că celulele stem oviductale umane au fost celula de origine în cancerul epitelial ovarian seros de grad înalt . Această constatare coroborează patologia umană recentă și dovezile modelului transgenic de șoarece, care au indicat că epiteliul oviductal distal este țesutul de origine al acestui cancer . În combinație cu sistemul CRISPR/Cas9, celulele stem normale de colon au fost transformate secvențial prin introducerea mutațiilor șoferului care sunt frecvent detectate în cancerul colorectal . Celulele rezultate au fost lăsate să formeze xenogrefe în capsula renală și au prezentat o transformare progresivă în fenotipuri asemănătoare adenocarcinomului caracterizate prin proprietăți invazive și metastatice. În general, capacitatea de a izola și cultiva celulele din țesuturile epiteliale normale potrivite tumorii și pacientului facilitează producerea unei platforme care nu numai că completează munca clasică in vivo a animalelor în domeniul biologiei cancerului, dar facilitează și abordările genetice și genomice specifice pacientului in vitro.
modelarea bolii inflamatorii cu celule stem adulte
modelarea bolii umane este împiedicată de accesibilitatea limitată a țesuturilor bolnave umane. Cu toate acestea, progresele în cultivarea celulelor stem adulte ne-au permis să reproducem fenotipurile bolii in vitro prin extinderea celulelor stem și derivarea tipurilor de celule mature din probe mici de biopsie umană. Deoarece metodele de cultură 3D, cum ar fi ALI și cultura organoidă, oferă structuri care constau din mai multe tipuri de celule și seamănă cu arhitectura epiteliului observată in vivo, acestea ar trebui să fie potrivite pentru studierea bolilor inflamatorii, inclusiv a bolilor infecțioase și ereditare. Mai exact, reproducerea fenotipului bolii este simplă atunci când agentul patogen (sau cauza principală) și tipul de celule vizate sunt cunoscute.
colita pseudomembranoasă (PMC) este cauzată de o populație disproporționat crescută de Clostridium difficile (C. difficile) după tratamentul cu antibiotice. C. difficile este o bacterie Gram-pozitivă, care formează spori și produce toxinele cu greutate moleculară mare TcdA și TcdB, care induc secreția de lichid, inflamația și deteriorarea țesutului colonic. Celulele epiteliale colonice diferențiate de celulele stem colonice clonogene în cultura ALI au fost contestate cu aceste toxine, care au provocat leziuni epiteliale devastatoare într – o manieră dependentă de timp și doză. Acest rezultat a indicat că modelul de cultură 3D poate fi utilizat pentru a reprezenta patologia C. difficile . În mod similar, efectul infecției cu Helicobacter pylori (H. pylori), care provoacă gastrită cronică, ulcere gastrice și cancer, a fost studiat prin microinjectarea H. pylori în culturi organoide. Culturile organoide infectate cu bacterii au prezentat o inflamație crescută, cum ar fi activarea NF-kB și inducția IL8, iar expresia IL8 a fost semnificativ mai mare în culturile organoide de tip glandă decât în culturile organoide de tip pit .
celulele stem adulte au fost, de asemenea, utilizate pentru a modela boala ereditară. Beekman și colegii săi au raportat o cultură organoidă intestinală derivată din pacienții cu fibroză chistică (CF). CF este cauzată de mutații ale regulatorului de conductanță transmembranară a fibrozei chistice (CFTR), care este exprimat în mod normal în celulele epiteliale ale multor organe, cum ar fi țesuturile pulmonare și digestive. Deși culturile organoide intestinale normale au prezentat umflături robuste ca răspuns la Forskolin, răspunsul de umflare nu a fost observat în culturile organoide CF . Mai mult, atunci când locusul CFTR mutant a fost corectat folosind tehnologia CRISPR/Cas9 la organoizii intestinali ai pacienților cu CF, s-a demonstrat că genele corectate funcționează funcțional . Prin urmare, diferențierea in vitro a celulelor stem adulte, asemănătoare fenotipurilor in vivo cu mai multe tipuri de celule în combinație cu tehnologiile de editare a genelor, oferă mijloace puternice pentru tratarea bolilor umane și poate oferi o perspectivă directă asupra patologiei umane.
aplicarea celulelor stem epiteliale pentru medicina regenerativă
în ciuda strategiilor promițătoare care utilizează celule stem embrionare umane și celule stem pluripotente induse (iPS) pentru aplicații în medicina regenerativă, puține studii clinice ale acestor strategii sunt în curs de desfășurare, ceea ce se datorează parțial dificultăților în specificarea liniei și posibilității de tumorigeneză. Deoarece celulele stem adulte sunt în esență angajate în tipuri de țesuturi specifice, producerea tipurilor de celule intenționate este relativ ușoară, iar riscul potențial de tumorigeneză este scăzut. Astfel, abordările terapeutice vizează utilizarea celulelor stem adulte ca sursă celulară pentru transplant. Deși Green și colegii săi au stabilit metoda de cultură a keratinocitelor umane în 1975 și celulele cultivate au fost transplantabile la pacienți cu arsuri sau leziuni chimice, cultivarea pe termen lung a altor tipuri de celule stem adulte a fost supusă unor bariere tehnice semnificative. După cum s-a descris mai sus, progresele tehnice recente au depășit această limitare pentru diverse tipuri de celule epiteliale. Prin urmare, capacitatea de a extinde rapid și eficient populațiile de celule stem este valoroasă pentru utilizarea lor în medicina regenerativă.
de exemplu, celulele stem colonice lgr5+ de șoarece au fost extinse în cultura organoidă și transplantate în colonul deteriorat de șoarece, iar celulele grefate care au fost capabile să se auto-reînnoiască și diferențiate au fost detectate chiar și după 25 de săptămâni . Într-o abordare diferită, Zhang K și colegii săi au folosit celule stem adulte proiectate pentru un studiu de transplant. În primul rând, au cultivat cu succes celulele epiteliale corneene într-un vas fără celule de alimentare și apoi au descoperit că Pax6 este un factor cheie de transcripție care diferențiază celulele stem corneene (CSC) de keratinocitele pielii. În mod surprinzător, supraexpresia Pax6 în keratinocite a indus celule asemănătoare celulelor stem limbale, iar aceste celule ar putea fi transplantate în corneele rănite ale iepurilor . Deoarece keratinocitele sunt mai ușor accesibile decât CSC-urile, această metodă poate fi aplicabilă pentru tratamentul bolii oculare umane. Mai recent, Liu și colab. a raportat o abordare atractivă pentru repararea și regenerarea țesuturilor care a utilizat celule stem endogene. În studiul lor, celulele stem epiteliale ale lentilelor (LECs) care au exprimat Pax6 și Bmi1 au fost caracterizate și au prezentat potențial regenerativ in vivo. A fost utilizată o metodă chirurgicală de îndepărtare a cataractei care păstrează LECs endogeni, iar acești LECs au contribuit la regenerarea spontană a lentilelor cu funcție vizuală la iepuri, macaci și sugari umani. Această metodă ar putea fi o descoperire terapeutică pentru tratamentul cataractei și ar putea înlocui implantarea artificială a lentilelor intraoculare .
datorită ratelor ridicate de rotație a multor celule epiteliale, transplantarea populațiilor de celule stem este esențială pentru întreținerea pe termen lung a țesuturilor. Teoretic, o singură celulă stem poate reconstitui țesuturi întregi, iar mai multe grupuri de cercetare au demonstrat empiric această noțiune . În ciuda potențialului celulelor stem pluripotente( CSP), care pot da naștere tuturor tipurilor de celule, celulele stem tisulare derivate din CSP nu pot fi menținute în starea imatură in vitro. Prin urmare, utilizarea celulelor stem adulte pentru medicina regenerativă prezintă un avantaj semnificativ.