isolering og langsigtet udvidelse af primære celler, især stamme/stamfaderpopulationer, er grundlæggende og vigtige grundlæggende teknikker inden for forskellige biologiske områder, herunder udviklingsbiologi og stamcellebiologi og medicinsk videnskab. Celler i stratificerede og søjleformede epitelvæv er meget regenererende og uforholdsmæssigt ansvarlige for mange humane kræftformer; kloning af voksne stamceller er imidlertid begrænset af vanskeligheder med at opretholde disse celler i en umoden tilstand. I de senere år har tekniske innovationer resulteret i hurtige og dramatiske fremskridt inden for stamcellebiologi, såsom brugen af små molekyler og vækstfaktorer til at efterligne vævsnichemiljøer og lette “Organoidkultur” .
i 1975 etablerede Rheinvald og Green det første vellykkede eksempel på human voksen stamcellekultur ved hjælp af humane keratinocytter . Specifikt opretholdt de humane keratinocytter på lang sigt i kombination med en subletalt bestrålet musefibroblastcellelinie, 3T3-J2. Selvom de ikke brugte udtrykket “stamceller” for klonede keratinocytter dyrket på 3T3 celler, fandt Green og kolleger kolonier med den bemærkelsesværdige evne til at opdele og danne nye kolonier efter passage, som de kaldte “Holokloner” . Disse holokloner består af små, umodne celler, der alle udviste intens nuklear farvning med p63, en masterregulator for stamhed, i stratificerede epitelceller . I det stratificerede epitel, inklusive hud, lungebronchia, brystkirtelog blære urothelium, stamcellepopulationen var hovedsageligt lokaliseret i basallaget, og umodne celler blev farvet med p63, i overensstemmelse med in vitro-undersøgelserne . Signifikant, isolerede og ekspanderede humane keratinocytter fra autolog hud er med succes podet for at brænde patienter og regenereret en permanent epidermis, der ligner det, der skyldes hudtransplantater med delt tykkelse . Især er den samme procedure blevet anvendt til at isolere og udvide humane hornhindeepitelceller til transplantation . Selvom denne teknologi var begrænset til stamceller i epidermis og hornhinde på det tidspunkt, skabte Green og kolleger grundlaget for kloning af menneskelige voksne stamceller inden for grundlæggende biologi og regenerativ medicin.
i denne gennemgangsartikel giver vi et overblik over nylige forskningsfremskridt og akkumulerende bevis for et cellekultursystem, der har ført til tekniske gennembrud inden for epitelcelleteknologier. Nye kulturstrategier for både stratificerede epitelceller og søjleepitelceller har gjort det muligt at rekapitulere menneskelig epiteludvikling og kan bruges til at generere en human sygdomsmodel in vitro. Vi diskuterer også de potentielle og mulige anvendelser af normale epitelcellekulturteknologier til regenerativ medicin og fremhæver et kræftcellekultursystem, der gengiver individuelle patientfænotyper.
stratificeret epitelcellekultur
i stratificeret epitelvæv, herunder glandulært og pseudostratificeret epitel, kan P63+-celler, som er lokaliseret på kældermembranen, selvfornyes for at opretholde stamme/stamfaderpopulationer og give anledning til afkom, der danner funktionelle væv . Som nævnt ovenfor er kloning og udvidelse af epitelstamceller, såsom hudkeratinocytter og hornhindeepitelceller, blevet veletableret i co-kultursystemer med bestrålede mus 3T3-J2 fibroblaster. Imidlertid har denne standardprotokol stort set været begrænset til den langsigtede kultur af keratinocytter og hornhindeceller. Ikke desto mindre er der rapporteret om klonede stamceller fra thymisk epitel, ligesom isoleringen af thymiske epitelstamceller fra forskellige arter, herunder humane celler, dyrket med et 3T3 feeder-system . Desuden anvendte Frey og kolleger for nylig 3T3 feeder-metoden til at isolere urotheliale stamceller, der udtrykte sonisk pindsvin og boede i det basale lag af blærens urothelium . Disse urotheliale stamceller fra isoleret humant og svinevæv blev stabilt dyrket på et 3T3 fødelag og var i stand til at give anledning til flere cellelinier, herunder P63+ basalceller og Uroplakin 2+ og 3+ urothelialceller, efter nyrekapseltransplantation i nøgne mus. I 2011 Pooja et al. udnyttede 3T3-kultursystemet til at isolere tre typer humane luftvejsepitelstamceller, dvs. og distale luftvejsstamceller, og fandt ud af, at disse luftvejsepitelstamceller udviste forskellige cellulære fænotyper efter in vitro-differentiering, skønt de umodne stamcellekloner syntes at være morfologisk uadskillelige (Fig. 1) . I en opfølgningsundersøgelse viste transplantationen af musetrakeale og distale luftvejsepitelstamceller, at distale luftvejsstamceller let blev inkorporeret i H1N1-beskadiget lungevæv og differentieret til flere epitelcelletyper, dvs., mens transplanterede trakeale stamceller kun var lokaliseret i større luftveje . Klonogene stamceller blev også isoleret fra humane spiserør endoskopiske biopsiprøver, og disse celler var i stand til at danne godt differentierede, stratificerede pladeepitellignende strukturer i et luftvæskegrænseflade (ALI) kultursystem .
skematisk af cellekulturprocessen for humane stratificerede og søjleepitelstamceller på et 3T3 museføderlag. For stratificerede epitelstamceller isoleres de fra biopsi, eller kirurgiske prøver er belagt på et 3T3-lag til en langsigtet kultur. For søjleepitelstamceller er de belagt på et 3T3-lag med definerede faktorer, der er essentielle for stamcellevækst og vedligeholdelse. Morfologisk umodne kolonier (pakkede kolonier med små celler) af epitelstamceller opsamles mekanisk for yderligere homogen ekspansion. I ALI-kulturen gennemgår cellerne differentiering i modne celletyper i en trans
Schlegel og kolleger rapporterede, at en Rho-associeret proteinkinase (ROCK) – hæmmer i kombination med 3T3-føderceller signifikant øgede den proliferative kapacitet af epitelstamceller, herunder humane keratinocytter, prostataceller og brystkirtelceller, og de kaldte dette fænomen “betinget omprogrammering” . Evnen til effektivt at generere epitelstamcellekulturer fra patienter giver kritisk og værdifuld indsigt i cellebaseret diagnostik og terapi . For nylig viste Rajagopal og kolleger, at TGF-Kurr/BMP/SMAD-signalvejen er vigtig i forskellige epitelvæv, herunder ektoderm-afledt hud-og brystkirtelvæv, endoderm-afledt spiserør og prostatavæv og mesoderm-afledt epididymis. De opdagede, at den dobbelte inhibering af SMAD-signalering (BMP-signalet blev blokeret af DMH-1, og TGF-Kurssignalet blev hæmmet af a-83-01) lettede den stabile udbredelse af humane og musepitel-basalcellepopulationer. Overraskende nok muliggjorde dobbelt TGF-LARP / BMP-hæmning den robuste udvidelse af epitelstamceller uden behov for mus 3T3-føderceller.
samlet set kan disse tekniske fremskridt i kombination med små molekyler og fødeceller bruges til kontinuerligt og effektivt at udvide stratificerede epitelstamme/stamfaderpopulationer in vitro. Et andet gennembrud i stratificeret epitelkultur, organoid kultur, er blevet brugt til at udvide både basale og luminale humane prostatafædre. Disse humane luminale forfædre var multipotente og dannede prostata-kirtellignende strukturer in vitro . Imidlertid er generering af tredimensionelle strukturer bestående af stratificeret eller pseudostratificeret epitel for at rekapitulere autentisk in vivo-arkitektur fortsat udfordrende, selvom mange forskere har rapporteret sfæroid-og organoidkulturer. Dette problem kan løses ved at etablere en metode til at lette selvorganisering, som udført i pluripotente stamcelleafledte væv .
Søjleepitelcellekultur
selvom tarmstamceller har den bemærkelsesværdige kapacitet til at proliferere med en høj omsætningshastighed for at opretholde tarmepitel, og hepatocytter er meget regenererende som reaktion på skader, er evnen til at klone stamcellepopulationer fra søjleepitelceller stærkt begrænset, formodentlig på grund af mangel på vævsniche signaler in vitro. I løbet af det sidste årti opdagede Clevers og kolleger LGR5 (leucinrig gentagelsesholdig G-proteinkoblet receptor 5), en intestinal stamcellemarkør, i en sofistikeret musemodel (Lgr5-EGFP-ires-CreERT2-mus krydset med den Cre-aktiverede Rosa26-reporter) og etablerede en musetarmorganoidkulturmetode, der består af villuslignende strukturer og Krypt-lignende områder med flere tarmcelletyper . I kombination med vækstfaktorer og cocktails med små molekyler blev en isoleret LGR5+ stamcellefraktion suspenderet i Matrigel og dyrket på lang sigt . Modificering af dyrkningstilstanden ved anvendelse af nicotinamid, en P38-og TGF-Larri-receptorinhibitor, humane epitelceller isoleret fra tyndtarmen og tyktarmen var i stand til uendeligt at ekspandere langsigtet in vitro . Denne teknik kan anvendes til dyrkning af andre typer celler , såsom bugspytkirtelkanalceller og hepatocytter, og letter revolutionerende fremskridt inden for søjleepitelcellekultur.
Organoidkultur anvender en Matrigel-baseret 3D-kulturplatform og kan i vid udstrækning bruges til stabilt at dyrke forskellige typer voksne epitelceller, herunder stratificerede epitelceller, med stamme/stamcellepopulationer . Evnen til hurtigt og effektivt at udbrede en brøkdel af ensartede stamceller in vitro er imidlertid også nyttig og vigtig for den detaljerede undersøgelse af selvfornyelse og skæbnespecifikation i vævsstamceller og mulige fremtidige anvendelser af celletransplantation til regenerativ medicin. Et nyt kultursystem til homogen udvidelse af humane føtale tarmstamceller, herunder tyndtarm og tyktarmsceller. Dette system anvendte et 3T3 museføderlag i kombination med vækstfaktorer og signalvejshæmmere for robust at udvide humane søjleepitelstamceller (Fig. 1) . Desuden var mere end 50% af tarmstamceller dyrket på 3T3 fibroblaster i stand til at danne kolonier. I pattedyrs tarm er definerede nichefaktorer, såsom vnt-og Haksignaler, afgørende for at styre stammen af tarmstamceller ved krypteringsbasen. Desuden opstår Paneth-celler, som også er placeret ved krypteringsbasen, fra stamceller og fungerer som stamcelleniche ved at tilvejebringe væsentlige faktorer på en parakrin måde. Fordi organoide kulturer består af stamceller og forskellige derivater, såsom Paneth-celler, leveres nichefaktorer autonomt . I modsætning hertil, fordi en ren population af tarmstamceller dyrkes på et 3T3-føderlag, kan cellerne ikke udskille nichefaktorer. Derfor skal ekstrinsiske faktorer, der ligner nichefaktorer, suppleres. Ud over stamcellevedligeholdelsesprotokollen er der etableret en differentieringsprotokol i en ALI-kulturmodel for at give anledning til mindst fire typer større tarmceller, dvs .Paneth-celler, entero-endokrine celler, bægerceller og enterocytter (intestinale absorberende celler). Dannelsen af intestinale villuslignende strukturer blev observeret i henhold til de oprindelige vævstyper, såsom tyndtarm og tyktarmsvæv (Fig. 1). I en anden ALI-kulturtilgang dyrkede Kuo og kolleger robust små stykker musens neonatale tarm med et stromalt element på lang sigt .
den samme strategi blev også anvendt på klone humane gastriske stamceller opnået fra endoskopisk biopsi. Specifikt blev klonogene gastriske celler stabilt udvidet på et 3T3-føderlag i kombination med vækstfaktorer og små molekyler og differentieret til gastriske epitellinjer, der typisk findes i maven, såsom pepsinogen-ekspressive hovedceller . Ud over klonede fordøjelsesorganstamceller var ovidukt-stamceller fra det distale livmoderrør også i stand til uendeligt at formere sig på et 3T3-føderlag i nærvær af nichefaktorer . Den distale ovidukt, fimbria epithelium, er et simpelt søjleepitellag, der består af følgende to typer celler: cilierede celler, som forbedrer transporten af kønsceller og sekretoriske celler, som udskiller slim. Ved hjælp af en lille ændring af differentieringsprotokollen for tarmstamceller gav langvarige ALI-dyrkede oviduktale stamceller anledning til en 3d-arkitektur, der indeholdt både cilierede og sekretoriske celler, der minder om in vivo-epitelstrukturen . Evnen til at producere epitellinjer med korrekte celletyper fra en stamcellepopulation kan være et nyttigt værktøj til at studere fysiologisk epiteludvikling og homeostase og udvikle akutte og kroniske sygdomsmodeller in vitro.
Kræftcellekultur
siden den første kræftcellelinie, HeLa-cellelinjen, blev etableret fra en livmoderhalskræftpatient i 1951 , er kræftcellelinjer etableret fra en lang række kræfttyper blevet brugt i vid udstrækning til at studere patobiologi af kræft og gav muligheder for at generere in vivo fremmedhad modeller og test anticancermedicin in vitro og in vivo. Selvom der er gjort enorme fremskridt inden for kræftbiologi ved hjælp af kræftcellelinjer, resultaterne opnået ved hjælp af disse celler afspejler muligvis ikke tilstrækkeligt sygdommens kompleksitet som oprindeligt forventet, fordi kræft udviser interpatient og intratumor heterogenitet, som afsløret af nylige fremskridt inden for næste generations sekventering . For mere præcist at afspejle kræftfænotyper, herunder patientens genmutationsstatus og patologi, udviklede vi og kolleger patientafledte ksenograft (PDK) modeller af brystkræft hos nonobese diabetic svær kombineret immundefekt (NOD-SCID) mus, der opretholdt de væsentlige træk ved de oprindelige tumorer og udviste metastatisk kapacitet til specifikke steder . Ud over brystkræftmodellen demonstrerede etableringen af forskellige typer faste tumorer muligheden for PDK-modeller, som forventes at fremskynde den prækliniske test af nye kræftterapier og hjælpe med at realisere målet om “personlig medicin”.
Kulturmetoder til voksne stamceller, såsom organoid-og feedersystemer, kan også anvendes til forskellige tilgange, der bruger patientafledte kræftceller. Specifikt rapporterede Clevers og kolleger , at organoidkultur kan bruges til at modellere bugspytkirtel , prostata og kolorektal cancer og viste, at de oprindelige kræftegenskaber, herunder genetisk heterogenitet og lægemiddelfølsomhed, kan rekapituleres. Derfor kaldte de dette system en “levende organoid biobank”. Disse teknologier kunne også bruges til at isolere en stamcellepopulation fra en precancerøs læsion, såsom Barretts spiserør, en forløber for humant esophageal adenocarcinom . Isolerede og ekspanderede Barretts spiserørstamceller blev transformeret ved at indføre SV40 large T antigen, hTERT og c-myc og ksenograft til immunkompromitterede NSG (NOD.CG-Prkdcscid Il2rgtm1jl/Sj) mus . Som forventet blev Barretts spiserørstamceller omdannet til esophageal adenocarcinoma-lignende tumorer hos mus. En lignende tilgang viste, at humane oviduktale stamceller var oprindelsescellen i højkvalitets serøs ovarieepitelkræft . Dette fund bekræfter den nylige humane patologi og det transgene musemodelbevis, som indikerede, at det distale oviduktale epitel er oprindelsesvævet for denne kræft . I kombination med CRISPR/Cas9-systemet blev normale kolonstamceller transformeret sekventielt ved at indføre drivermutationer, der ofte påvises i kolorektal cancer . De resulterende celler fik lov til at danne røntgenbilleder i nyrekapslen og udviste progressiv transformation til adenocarcinomlignende fænotyper karakteriseret ved invasive og metastatiske egenskaber. Samlet set letter evnen til at isolere og dyrke celler fra tumor – og patientmatchede normale epitelvæv produktionen af en platform, der ikke kun supplerer klassisk in vivo dyrearbejde inden for kræftbiologi, men også letter patientspecifik genetik og genomiske tilgange in vitro.
modellering af inflammationssygdom med voksne stamceller
modellering af menneskelig sygdom hindres af den begrænsede tilgængelighed af humane syge væv. Ikke desto mindre har fremskridt inden for dyrkning af voksne stamceller gjort det muligt for os at reproducere sygdomsfænotyper in vitro ved at udvide stamceller og udlede modne celletyper fra små humane biopsiprøver. Da 3D-kulturmetoder, såsom ALI og organoidkultur, tilvejebringer strukturer, der består af flere celletyper og ligner epitelarkitekturen observeret in vivo, bør de være egnede til at studere inflammatoriske sygdomme, herunder infektiøse og arvelige sygdomme. Specifikt er reproduktion af sygdomsfænotypen enkel, når patogenet (eller hovedårsagen) og målrettet celletype er kendt.
pseudomembranøs colitis (PMC) er forårsaget af en uforholdsmæssigt øget population af Clostridium difficile (C. difficile) efter antibiotikabehandling. C. difficile er en Gram-positiv, sporeformende bakterie og producerer toksinerne med høj molekylvægt TcdA og TcdB, som inducerer væskesekretion, betændelse og colonvævskader. Kolonepitelceller differentieret fra klonogene kolonstamceller i ALI – kultur blev udfordret med disse toksiner, hvilket forårsagede ødelæggende epitelskader på en tids-og dosisafhængig måde. Dette resultat indikerede, at 3D-kulturmodellen kan bruges til at repræsentere C. difficile patologi . Tilsvarende blev virkningen af Helicobacter pylori (H. pylori) infektion, der forårsager kronisk gastritis, mavesår og kræft, undersøgt ved mikroinjektion af H. pylori i organoidkulturer. Bakterieinficerede organoidkulturer udviste øget betændelse, såsom NF-kB-aktivering og IL8-induktion, og IL8-ekspression var signifikant højere i organoidkulturer af kirteltype end i organoidkulturer af pit-type .
voksne stamceller er også blevet brugt til at modellere arvelig sygdom. Beekman og kolleger rapporterede om en tarmorganoidkultur afledt af cystisk fibrose (CF) patienter. CF er forårsaget af mutationer i cystisk fibrose transmembran konduktansregulator (CFTR), som normalt udtrykkes i epitelcellerne i mange organer, såsom lunge-og fordøjelsesvæv. Selvom normale intestinale organoidkulturer udviste robust hævelse som reaktion på Forskolin, blev hævelsesresponset ikke observeret i CF organoidkulturer . Når det muterede CFTR-locus blev korrigeret ved hjælp af CRISPR/Cas9-teknologien i tarmorganoider hos CF-patienter, blev de korrigerede gener vist at fungere funktionelt . Derfor giver in vitro-differentiering af voksne stamceller, der ligner in vivo fænotyper med flere celletyper i kombination med genredigeringsteknologier, effektive midler til behandling af menneskelig sygdom og kan give direkte indsigt i menneskelig patologi.
anvendelse af epitelstamceller til regenerativ medicin
på trods af lovende strategier, der bruger humane embryonale stamceller og inducerede pluripotente stamceller (iPS) celler til applikationer i regenerativ medicin, er der få kliniske forsøg med disse strategier i gang, hvilket delvis skyldes vanskeligheder med afstamningsspecifikation og muligheden for tumorigenese. Fordi voksne stamceller i det væsentlige er forpligtet til specifikke vævstyper, er det relativt let at producere tilsigtede celletyper, og den potentielle risiko for tumorigenese er lav. Således sigter terapeutiske tilgange mod at bruge voksne stamceller som cellekilde til transplantation. Selvom Green og kolleger etablerede den humane keratinocytkulturmetode i 1975, og de dyrkede celler kunne transplanteres til patienter med forbrændinger eller kemiske skader, var den langsigtede dyrkning af andre typer voksne stamceller underlagt betydelige tekniske barrierer. Som beskrevet ovenfor overvandt de seneste tekniske fremskridt denne begrænsning for forskellige typer epitelceller. Derfor er evnen til hurtigt og effektivt at udvide stamcellepopulationer værdifuld til deres anvendelse i regenerativ medicin.
for eksempel er mus Lgr5+ kolonstamceller blevet udvidet i organoidkultur og transplanteret i det beskadigede musekolon, og indpodede celler, der var i stand til selvfornyelse og differentiering, blev påvist selv efter 25 uger . I en anden tilgang udnyttede Jang K og kolleger konstruerede voksne stamceller til en transplantationsundersøgelse. Først dyrkede de med succes hornhindeepitelceller i en skål uden føderceller og fandt derefter, at Paks6 er en nøgletranskriptionsfaktor, der adskiller hornhindestamceller (CSC ‘ er) fra hudkeratinocytter. Overraskende nok inducerede Paks6-overekspression i keratinocytter limbale stamcellelignende celler, og disse celler kunne transplanteres i de skadede hornhinder hos kaniner . Da keratinocytter er lettere tilgængelige end CSC ‘ er, kan denne metode være anvendelig til behandling af menneskelig øjensygdom. For nylig, Liu et al. rapporteret en attraktiv tilgang til vævsreparation og regenerering, der brugte endogene stamceller. I deres undersøgelse blev linsepitelstamceller (Lec ‘ er), der udtrykte Paks6 og Bmi1, karakteriseret og udviste regenerativt potentiale in vivo. En kirurgisk kataraktfjernelsesmetode, der bevarer endogene Lec ‘er, blev anvendt, og disse Lec’ er bidrog til spontan regenerering af linser med visuel funktion hos kaniner, makakker og menneskelige spædbørn. Denne metode kan være et terapeutisk gennembrud til kataraktbehandling og potentielt erstatte kunstig intraokulær linseimplantation .
på grund af de høje omsætningshastigheder for mange epitelceller er transplantation af stamcellepopulationer afgørende for langvarig vævsvedligeholdelse. Teoretisk set kan en enkelt stamcelle rekonstituere hele væv, og flere forskningsgrupper demonstrerede empirisk denne forestilling . På trods af potentialet i pluripotente stamceller (PSC ‘ er), som kan give anledning til alle celletyper, kan PSC-afledte vævsstamceller sandsynligvis ikke opretholdes i umoden tilstand in vitro. Derfor giver brugen af voksne stamceller til regenerativ medicin en betydelig fordel.