PMC

HCV RNA-kvantificering.

formålet med denne undersøgelse var at udvikle en simpel realtids-PCR-analyse til kvantificering af HCV RNA i både serum-og leverprøver med SYBR Green i-detektion snarere end brugen af mærkede prober. Realtids-PCR-analyser blev udført med en LightCycler (Roche) med både single-round amplifikation og en ny begrænset cyklus indlejret amplifikation. RNA-standarder blev transkriberet med T7-polymerase fra amplikoner afledt af 5′ ikke-translaterede Region-PCR-produkter klonet til Pgem-t Easy (Promega) og behandlet to gange med RK1 DNase. RNA ‘ et blev kvantificeret ved spektrofotometri. Til enkelt runde kvantificering af serumprøver blev RNA revers transkriberet som beskrevet tidligere (7). Til nestet PCR-kvantificering med begrænset cyklus blev en RT-PCR udført i en Et-trins reaktion med 15 cyklusser af PCR (det begrænsede cyklustrin) efterfulgt af en realtids-PCR. HCV-belastninger blev målt ved realtids-PCR med ydre primere KY78 og KY80 til enkeltrunde reaktioner (21) eller ydre primere plus indre primere hep21b og hep22 til indlejrede reaktioner med begrænset cyklus (19). Reaktionsblandinger omfattede 2 liter Fast Start DNA Master SYBR Green i (Roche), 4 mM MgCl2, en 0,5 liter koncentration af hver primer og 2 liter af skabelonen i et samlet volumen på 20 liter. Efter inkubationer i 10 minutter ved 95 liter C, LightCycler PCR blev udført i 40 cyklusser, hver cyklus bestående af 15 sekunder ved 95 liter C, udglødning ved 60 liter C i 5 sekunder, og forlængelse ved 72 liter C i 10 sekunder. Fluorescens blev overvåget ved 530 nm, og signalets specificitet blev kontrolleret ved smeltekurveanalyse.

med syntetisk HCV-RNA som skabelon var følsomheden af den enkeltrunde realtids-PCR-analyse ca.103 HCV-kopier/reaktion eller 5 liter 104 kopier/ml, når fortyndingsfaktoren blev beregnet. Der blev observeret et bredt lineært forhold (op til 6,5 liter 108 kopier/reaktion) mellem antallet af PCR-cyklusser, der var nødvendige for at detektere et fluorescenssignal, og antallet af HCV-kopier. Vi målte serumvirusbelastningen på 24 patienter kronisk inficeret med forskellige HCV-genotyper, der er fremherskende i Australien (1a, 1b, 2a, 2b, 2c og 3a) (6). Tre patienter havde virale belastninger under følsomheden af denne version af assayet (5 liter 104 kopier/ml), skønt de var positive ved et kvalitativt internt indlejret RT-PCR-assay (19). De resterende 21 patienter havde virusbelastninger, der varierede fra 2,8 liter 105 til 9,1 liter 106 kopier/ml. For at øge følsomheden og specificiteten af analysen blev en 15-cyklus, et-trins RT-PCR introduceret med en efterfølgende realtids kvantitativ PCR til anden runde. Med syntetisk RNA var den modificerede metode i stand til at detektere en bred vifte af HCV-kopitalnumre (fra 28 til 2,8 liter 106 HCV-kopier/reaktion) under opretholdelse af linearitet. Følsomheden af den begrænsede cyklus nestede KRT-PCR-analyse var større end 28 kopier/reaktion (eller 1.400 kopier/ml), hvilket var cirka 40 gange større end den for den enkeltrunde KRT-PCR-analyse. Følsomheden af dette assay kan sammenlignes positivt med de tidligere rapporterede metoder, der anvender realtidskvantificering med Takman-teknologi (Roche) og et Abi Prism 7700 sekvensdetekteringssystem (Perkin-Elmer), som har rapporteret følsomheder på 10 kopier/reaktion (9, 16) og 1.000 kopier/reaktion (12). Følsomheden af LightCycler (Roche) og SYBR Green i detektion er også rapporteret at være 10 kopier/reaktion (10). For yderligere at validere denne version af analysen er de virale belastninger af 16 HCV-positive serumprøver, der varierede fra 1-liter 103 til 1.2 liter 106 kopier / ml (som bestemt med Amplicor Monitor assayet) viste sig at korrelere tæt med resultater opnået med det indlejrede realtids-PCR-assay (r= 0,876, P < 0,0001, n = 16) (Fig. (Fig.11).

HCV replikerer i leveren, men få undersøgelser har forsøgt at relatere virale belastninger i leveren til kliniske resultater og foretrækker at undersøge den forudsigelige værdi af serumvirusbelastninger. Sidstnævnte kunne betragtes som et passende surrogat til hepatiske virale belastninger, hvis de blev vist at korrelere, men få undersøgelser har vist dette, og de resultater, der er rapporteret til dato, er ikke overbevisende. Den begrænsede cyklus nestede PCR-analyse blev derfor brugt til at måle hepatiske HCV-belastninger. Den mængde levervæv, der blev anvendt til analyse, vejede mellem 0, 8 og 8, 1 mg (gennemsnit = 3.88-2,1 mg), hvorfra 2,1-12,9 – (middel = 6,62-3,1 – – 3,1 – – 3,1 – – RNA blev ekstraheret. Udbyttet af total RNA var i gennemsnit 1,71 liter 103 liter/g levervæv, en værdi svarende til den, der blev fundet i en tidligere undersøgelse af 1,01 liter 103 liter RNA/g (13). Hepatisk virale belastninger varierede fra 3,0 × 102 1,3 × 106 HCV RNA-molekyler/µg af den samlede RNA, og gennemsnittet var 2,38 × 105 ± 3.55 × 105 kopier/µg RNA. Der er påvist en korrelation mellem hepatiske virale belastninger målt i antallet af HCV-kopier pr.mikrogram total RNA og serum virale belastninger målt med Amplicor Monitor-analysen, skønt den var svag (r = 0,417, n = 20) (13). Andre undersøgelser har vist, at HCV RNA-belastningen i serum afspejles væsentligt af mængden af virus i leveren uden at tilvejebringe korrelationskoefficienter (3, 8). Her rapporterer vi for første gang en statistisk signifikant sammenhæng mellem lever-og serumviral belastningsmålinger (r = 0,689, P = 0.004, n = 15), hvilket indikerer, at niveauet af viræmi faktisk afspejler mængden af virus, der er til stede i leveren (Fig. (Fig.22).

i tidligere undersøgelser er målinger af leverviral belastning udtrykt som antallet af kopier pr. milligram levervæv eller antallet af kopier pr.mikrogram total RNA. I denne undersøgelse viser vi, at begge enheder synes at være egnede, da der var en signifikant sammenhæng mellem virale belastninger målt med hensyn til antallet af kopier pr.milligram levervæv og dem målt som antallet af kopier pr. mikrogram total RNA (r = 0,937, P < 0,0001, n = 20) (Fig. (Fig.3).3). Disse resultater er i overensstemmelse med de Moliner et al. (3), som også viste en tæt sammenhæng mellem den virale belastning i leveren, udtrykt som antallet af kopier pr.gram væv og antallet af kopier pr. mikrogram total cellulært RNA (r = 0,85) (3). Det gennemsnitlige antal af HCV RNA-molekyler per gram af levervæv 2,1 × 108 ± 3.71 × 108, omkring 170 gange højere end RNA-niveauer i serum (1.22 × 106 ± 2.0 × 106 kopier/ml). Dette fund svarer til Terrault et al. (18), der viste, at forholdet mellem HCV RNA i leveren og det i serum var 103:1. I modsætning, McGuiness et al. (13) fandt, at niveauet i levervæv var større med en faktor på >104. Denne forskel kan forholde sig til det faktum, at den hepatiske virale belastninger af patienter i det tidligere studie, som overvejende havde avancerede HCV-infektion, blev omkring ottefoldige højere (1.83 × 106 ± 0.75 × 106 kopier/µg RNA) end dem, der registreres i den foreliggende undersøgelse (2.38 × 105 ± 3.55 × 105 kopier/µg RNA).

som konklusion er realtids-PCR-analysen en følsom, nøjagtig og pålidelig metode til overvågning af HCV-belastninger i både serum-og leverprøver.