ADP-Ribosylierung
Lange Zeit wurde angenommen, dass die Funktion des Coenzyms NAD mit seiner Rolle bei Redoxreaktionen zusammenhängt. In den letzten 20 Jahren deuteten experimentelle Beweise jedoch darauf hin, dass NAD an ADP-Ribosylierungsereignissen beteiligt ist.
In NAD setzt die Spaltung der glykosidischen Bindung zwischen dem C1′ von Ribose und N11 von Nicotinamid Nicotinamid und ADP-Ribosyl frei (Abb. 24.1). Dieses kann an eine Vielzahl von Akzeptormolekülen gebunden sein. Zahlreiche NAD-abhängige Reaktionen für den Transfer von ADP-Ribose (ADP-Ribosylierung) sind bekannt; alle sind von großer funktioneller Bedeutung.
Abbildung 24.1. ADP-Ribose.
Mono-ADP-Ribosylierung. Bei dieser posttranslationalen Modifikation wird das ADP-Ribosyl aus NAD auf einen Aminoacylrest (Arginin, Cystein, Asparagin oder Histidin) eines Akzeptorproteins übertragen. Es sollte beachtet werden, dass die Bindung des ADP-Ribosylnicotinamids in NAD eine hochenergetische Bindung ist; sein Bruch liefert die Energie, die die Reaktion ermöglicht. Mono-Adenosindiphosphat-Ribosyltransferase (ART), die zunächst in Bakterientoxinen und später in eukaryotischen Zellen beschrieben wurde, katalysiert die Reaktion.
Choleratoxin fördert den Transfer von Mono-ADP-Ribosyl in die α-Untereinheit des Gs-Proteins und aktiviert es. Dies führt zu einer Stimulation der Adenylatcyclase, einer Erhöhung der zyklischen AMP-Spiegel und einer höheren Funktion der Ionentransportkanäle in der Luminalmembran von Enterozyten. Dies verursacht schweren Durchfall, ein charakteristisches Symptom der Cholera-Toxin-Infektion. Das Pertussis-Toxin (produziert von den Bakterien, die Keuchhusten verursachen) bestimmt die ADP-Ribosylierung von Cysteinylresten und entkoppelt G-Protein von seinem Rezeptor. Diphtherietoxin und Pseudomonas-Exotoxin stoppen die Proteinsynthese durch ADP-Ribosylierung des Dehnungsfaktors 2 (EF2). Clostridiumtoxin ADP-ribosyliert Aktinmoleküle und verhindert deren Polymerisation. Diese Wirkungen zeigen, dass die Mono-ADP-Ribosylierung die Funktion des modifizierten Proteins deutlich beeinflusst.
Beim Menschen wurden mehrere ADP-Ribosylierungsenzyme erkannt. Einige sind durch Glycosyl-Phosphatidylinositol an der äußeren Oberfläche der Plasmamembran verankert (Ektoenzyme) und andere befinden sich innerhalb der Zelle (Endoenzyme).
Auffallend war der Befund von Ektoenzymen, die auf NAD in den Zellen wirken. Es wird angenommen, dass diese Enzyme das NAD verwenden, das von lysierten Zellen in den interstitiellen Raum freigesetzt wird; Alternativ wurde die Existenz von Kanälen vorgeschlagen, die den Austritt von NAD durch die Plasmamembran ermöglichen. Die Ektoenzyme sind funktionell mit der Modulation der Myozytendifferenzierung und anderen Prozessen verbunden, die mit Immun- und Entzündungsreaktionen verbunden sind, wie Chemotaxis, Rekrutierung von Neutrophilen, Hemmung der T-Zell-Zytotoxizität und Zelladhäsion.
Intrazelluläre ARTs sind an der Regulation von Signaltransduktionssystemen beteiligt, an denen G-Proteine beteiligt sind und als ART-Substrate dienen. Die Mono-ADP-Ribosylierung kann die Signalübertragung beeinflussen und verschiedene zelluläre Effekte fördern. Die Hemmung der Proteintranslation, die Regulation des Golgi-Apparats und die Funktion des Zytoskeletts sind ein Ergebnis dieser posttranslationalen Modifikationen.
Poly-ADP-Ribosylierung. Dies ist eine andere Art der posttranslationalen Modifikation, die durch Poly-Adenosindiphosphat-Ribosylpolymerasen (PARP) katalysiert wird. Achtzehn PARP-Gene wurden identifiziert, aber nicht alle von diesen Genen kodierten Enzyme wurden charakterisiert. PARP bindet zunächst ADP-Ribosyl an Glutamyl- oder Aspartylreste im Akzeptorprotein. Dann setzt es das Einfügen von ADP-Ribosylmolekülen fort und bindet sie linear durch glykosidische 1′
2′-Bindungen. Alle 40-50 Einheiten werden Verzweigungspunkte in der Hauptkette erstellt, wobei 1′ 3′ -Bindungen eingefügt werden. PARP kann auch Auto-Poly-ADP-Ribosylierung durchlaufen; Eines der Hauptsubstrate von PARP ist PARP selbst.
ADP-Ribosepolymere sind stark elektronegativ und beeinflussen die Eigenschaften des modifizierten Proteins. Die Zunahme der negativen Ladung des Proteins verstärkt die Abstoßung des ADP-ribosylierten Proteins mit anderen Polyanionen, wie DNA; oder zieht positiv geladene Moleküle wie Histone an.
Unter den bekannten ADP-Ribosylpolymerasen befinden sich einige im Zellkern. PARP-1 und PARP-2 werden durch das Vorhandensein von gespaltenen Stellen in den DNA-Strängen aktiviert, an die PARP bindet. Diese gespaltenen Stellen treten normalerweise während der DNA-Replikation und -reparatur auf oder können durch äußere Einflüsse verursacht werden. PARP-3 ist häufig mit dem Zentrosom assoziiert und PARP-4 ist mit Ribonukleoproteinpartikeln assoziiert. PARP-7 und PARP-10 sind an der Histonribosylierung beteiligt. TNKS und TNKS-2 sind ebenfalls Poly-ADP-Ribosylpolymerasen und sie sind mit Telomeren assoziiert.
Die Modifikation durch Poly-ADP-Ribosylierung von basischen Proteinen, wie Histonen, verändert DNA-Histon-Wechselwirkungen sowie Intra- und Internukleosomen-Attraktionen und fördert eine lockere Chromatinstruktur. Dies erleichtert den Zugang zu DNA von Enzymen, die an den Prozessen der Replikation und Reparatur beteiligt sind, einschließlich Helicase, Topoisomerase, Polymerase und Ligase. Das PARP-ADP-auto-Polyribosylat neigt dazu, nahe gelegene DNA-Stränge abzustoßen, wenn seine elektronegative Ladung zunimmt, und trennt sich schließlich.
Mit Telomeren assoziiertes PARP fördert die Telomeraseaktivität bei der Chromosomendehnung. Darüber hinaus dient ihre Anwesenheit dazu, andere DNA-Stränge abzuwehren und Anomalien wie Translokationen und End-to-End- oder schädliche Rekombinationsfusionen zu verhindern.
Die Poly-ADP-Ribosylierung einiger Enzyme kann ihre Aktivität verändern; Zum Beispiel kann es die DNA-Ligase stimulieren und die Endonuklease hemmen, wodurch der DNA-Abbau verhindert wird.
PARP ist an der Regulation der Chromatinstruktur, Transkription, Replikation, Reparatur, Aufrechterhaltung der DNA-Integrität und Stimulation der DNA-Ligase beteiligt. Das Fehlen oder die Abnahme der PARP-Aktivität führt zu Genominstabilität.
Mit Zentrosomen assoziiertes PARP trägt zu einer geordneten Trennung der Chromosomen während der Mitose bei.
PARP ist auch an der Zelldifferenzierung und dem Proteinabbau während des programmierten Zelltods beteiligt (Apoptose, Kapitel 32). Die Wirkmechanismen sind noch nicht klar verstanden. PARP vermittelt Apoptose durch proinflammatorische Signale. Es steuert die Freisetzung des Apoptose-induzierenden Faktors (AIF) aus Mitochondrien. Neuere Studien haben auch eine Beziehung zwischen Poly-ADP-Ribosylierung und Polyubiquitinierung bei der Markierung von Proteinen für den Abbau gezeigt.
Bei Zellstress kann eine Überaktivierung von PARP zu einem Abbau von NAD und ATP führen, mit verheerenden Folgen für die Zelle, die in einer Zellnekrose enden.
Studien an Labortieren haben gezeigt, dass sich ischämische Zustände im Gehirn und im Herzen unter septischem Schock oder schwere Entzündungsprozesse verbessern, wenn PARP gehemmt wird. Es ist wahrscheinlich, dass diese Beobachtungen klinische Anwendung finden werden; Die Herausforderung einer reduzierten ADP-Ribose-Polymerase-Aktivität, die zu einer Destabilisierung des Genoms, einer Akkumulation von Mutationen und schließlich zu einer malignen Transformation (Karzinogenese) führt, muss jedoch zunächst gelöst werden.
Die ADP-Ribose-Polymere werden durch die Poly-ADP-Ribose-Glycohydrolase abgebaut, die freie ADP-Ribose freisetzt. Eine ADP-Ribose-Lyase setzt die erste an das Protein gebundene Einheit frei. Pyrophosphatase trennt AMP und Ribosephosphat.
NAD-abhängige Deacetylierung. Es gibt eine Proteinfamilie von NAD-abhängigen Deacetylasen namens Sirtuine, die die Nikotinamidgruppe aus NAD freisetzen und von Proteinen getrenntes Acetat als ADP-Ribosylakzeptor zur Bildung von 2′-O-Acetyl-ADP-Ribose verwenden. Diese Aktivität wurde zuerst in Hefe beobachtet und mit dem Akronym SIR (Silent Information regulator) bezeichnet; später wurde es auch im Nematoden Caenorhabditis elegans und in Drosophila melanogaster nachgewiesen. Ihre Wirkung erhöht die Lebensdauer dieser Organismen, insbesondere unter Bedingungen, unter denen die Nährstoffe im Medium begrenzt sind.
Sirtuine (SIRT) umfassen eine Familie von sieben Proteinmitgliedern (SIRT-1 bis SIRT-7), die als eine Variante von ADP-Ribosylasen angesehen werden können. Sie verwenden verschiedene Substrate wie Histone, p53-Protein, Transkriptionsfaktoren, Kernfaktor kB und andere. Beispielsweise induziert die Histondeacetylierung eine kompaktere Struktur des Chromatins, die die Genstummschaltung fördert und kritische Bereiche der Chromosomen wie Telomere und Zentrosomen schützt. Die Deacetylierung des Proteins p53 ist wichtig für die genomische Stabilität; Es steuert den Zellzyklus, die DNA-Reparatur und die Apoptose. Die Deacetylierung von p53 erhöht offenbar seine Stabilität, indem es die Ubiquitinierung blockiert.
SIRT 1 ist am Energiestoffwechsel, der oxidativen Stressreaktion, der Zellseneszenz und dem Schutz von Gefäßendothelien und Nerven bei verschiedenen pathologischen Zuständen beteiligt.
Nikotinamid, das aus NAD-abhängigen Deacetylierungen freigesetzt wird, wirkt als potenter Inhibitor der Aktivität von Sirtuin und trägt zu seiner Regulation bei.
Da die Wirkung von Sirtuinen in einigen Organismen zur Verlängerung des Lebens beiträgt, wurde angenommen, dass es sich um einen allgemeinen Verlängerungsfaktor handelt. Es gibt jedoch noch nicht genügend Beweise, um diese Ergebnisse auf höhere Tiere zu extrapolieren.
Es wird angenommen, dass die Aufrechterhaltung normaler Spiegel von Poly-PARP-Polymerasen und Sirtuinen in den Zellen die Karzinogenese und alterungsbedingte Störungen verhindern oder verzögern kann.
Das aus Sirtuin-Aktivität resultierende Produkt 2′-O-acetyl-ADP-ribose fungiert als Second Messenger.
Reaktionen, die nicht mit der posttranslationalen Proteinmodifikation zusammenhängen, aber als Varianten der ADP-Ribosylierung betrachtet werden können, erzeugen Verbindungen mit wichtiger physiologischer Wirkung: cyclische ADP-Ribose und Nicotinsäure-ADP-Ribose-phosphat (NAADP) (siehe S. 669).