ELISA: Wie man experimentelle Ergebnisse analysiert

Von Dr. Surat P, Ph.D.Bewertet von Dr. Tomislav Meštrović, MD, Ph.D.

ELISA oder Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ist ein Werkzeug zum Nachweis und zur Quantifizierung von Substanzen wie Peptiden, Proteinen, Antikörpern und Hormonen. Es beinhaltet die Immobilisierung eines Antigens oder Antikörpers auf einer Oberfläche, gefolgt von der Zugabe einer zu analysierenden Probe. Der Nachweis ist abhängig von einer spezifischen Antigen-Antikörper-Reaktion.

Jarun Ontakrai |

Was ist vor dem Ausführen eines ELISA zu tun?

Ein ELISA-Test sollte immer in Replikaten (Duplikaten oder Triplikaten) durchgeführt werden, um eine ausreichende Anzahl von Proben zur Berechnung der Standardabweichung und des Koeffizienten zu erreichen der Variation. Der Fehlerkoeffizient sollte weniger als 20% betragen. Wenn der berechnete Fehler hoch ist, müssen Fehler, die durch Pipettieren, Kontamination von Platten und Reagenzien, Verdampfung und / oder Temperatur entstehen, ausgewertet werden.

Standardkurve

Eine Standardkurve wird verwendet, um die Konzentration der Probe zu messen. Zunächst werden die Extinktionswerte von Standardkonzentrationen (pg/ml) aufgetragen. Es wird auch eine negative Kurve erstellt, die keine Standardabtastdaten enthält und zur Erkennung und Messung von Hintergrundgeräuschen verwendet wird. Für eine genaue Messung muss dieser Hintergrundwert von der Standardkurve abgezogen werden.

Die Extinktionswerte bekannter Konzentration können als Positivkontrolle aufgetragen werden. Die Konzentration des Zielproteins wird abgeleitet, indem zuerst die mittlere Absorption berechnet und dann die Standardkurve zur Schätzung der Konzentration verwendet wird.

Verdünnungsfaktoren sollten ebenfalls berücksichtigt werden. Wenn die Probe beispielsweise vierfach verdünnt wurde, sollte die Extinktion mit vier multipliziert werden, bevor die Standardkurve zur Ableitung der Konzentration verwendet wird.

Variationskoeffizient

Die Definition des Variationskoeffizienten ist das Verhältnis von Standardabweichung und Mittelwert – d. H. Standardabweichung (σ) / Mittelwert (µ). Große Werte des Variationskoeffizienten weisen auf Ungenauigkeiten aufgrund von Pipettieren oder Mischen von Reagenzien zwischen Wells, bakterieller oder pilzlicher Kontamination, Austrocknen von Wells oder Temperaturschwankungen hin.

Spike Recovery

Der nach dem Ausführen des ELISA-Tests erhaltene Wert hängt davon ab, wie ein Zielprotein mit den Antikörpern interagiert, und diese Interaktion wird mit einer Standardproteinkurve verglichen. Mehrere Faktoren – einschließlich Puffer, Matrix und heterophile Antikörper – können die Bindung der Probe beeinflussen, daher muss dies bei der Bestimmung der Genauigkeit eines ELISA berücksichtigt werden.

Ein Spike-Assay kann durchgeführt werden, um die Genauigkeit der ELISA-Ergebnisse zu bestimmen. Bei diesem Assay wird der Probe eine bekannte Menge rekombinanten Proteins zugesetzt oder zudosiert. Dann wird unter Verwendung der Standardkurve die Materialmenge gemessen. Große Abweichungen der Messwerte können auf Fehler aufgrund unbekannter Elemente im Assay hinweisen.

Linearitätstest

Linearitätstest wird auch verwendet, um die Genauigkeit von ELISA zu bestimmen. In diesem Fall wird die ‚gespickte Probe‘ seriell auf 1:2, 1:4 und 1:8 verdünnt. Wenn die Konzentration der veränderten Probe nachgewiesen wird und die Ergebnisse keine lineare Änderung der Messungen anzeigen, kann dies auf Fehler in der Genauigkeit des ELISA hinweisen.

In einigen Fällen können bei bestimmten Konzentrationen Fehler beobachtet werden und bei niedrigeren Konzentrationen nicht mehr. In solchen Fällen muss die Probe möglicherweise verdünnt werden, bevor die Konzentrationsmessungen durchgeführt werden.

Fehlerbehebung

Hintergrundgeräusche können durch eine Reihe von Faktoren verursacht werden, darunter:

• Unzureichendes Waschen der Wells
• Kontaminierte Waschpuffer
• Zu viel Nachweisreagenz
• Kreuzreaktivität des Antikörpers
• Ausfällung des Puffers und /oder Analyten

Manchmal kann eine schlechte Standardkurve erzeugt werden. Dies kann auf Fehler in der Standardlösung, eine Verschlechterung des Standards, eine unsachgemäße Rekonstitution des Standards oder darauf zurückzuführen sein, dass die Kurve nicht zur Skala passt. In Anbetracht des letzteren kann das Plotten mit verschiedenen Skalen erfolgen, z. B. Log-Log oder 5-Parameter-Logistikkurve.

Weiterführende Literatur

• Alle ELISA-Inhalte (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
• ELISA-Anwendungen
• Western Blot – Labortechnik zum Nachweis von Proteinen
• Antikörperanwendungen
• Messung der Genexpression

Geschrieben von

Dr. Surat P

Dr. Surat promovierte. in Zellbiologie und Mechanobiologie vom Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, Indien) im Jahr 2016. Vor ihrer Promotion studierte Surat einen Bachelor of Science (B.Sc .) Abschluss in Zoologie, während dessen sie ein Sommerstipendium der Indischen Akademie der Wissenschaften erhielt, um die an AIDs beteiligten Proteine zu untersuchen. Sie produziert Feature-Artikel zu einer Vielzahl von Themen, wie medizinische Ethik, Datenmanipulation, Pseudowissenschaft und Aberglaube, Bildung, und die menschliche Evolution. Sie begeistert sich für Wissenschaftskommunikation und schreibt Artikel zu allen Bereichen der Life Sciences.

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