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HCV-RNA-Quantifizierung.

Ziel dieser Studie war die Entwicklung eines einfachen Echtzeit-QRT-PCR-Assays zur Quantifizierung von HCV-RNA in Serum- und Leberproben mit SYBR-I-Nachweis anstelle der Verwendung markierter Sonden. Echtzeit-QRT-PCR-Assays wurden mit einem LightCycler (Roche) mit Single-Round-Amplifikation und einer neuartigen verschachtelten Amplifikation mit begrenztem Zyklus durchgeführt. RNA-Standards wurden mit T7-Polymerase aus Amplikons transkribiert, die von nicht translatierten 5′-Region-PCR-Produkten abgeleitet waren, die in pGEM-T Easy (Promega) kloniert und zweimal mit RQ1-DNase behandelt wurden. Die RNA wurde spektralphotometrisch quantifiziert. Für die Single-Round-Quantifizierung von Serumproben wurde RNA wie zuvor beschrieben reverse transkribiert (7). Zur Quantifizierung der verschachtelten PCR mit begrenztem Zyklus wurde eine RT-PCR in einer einstufigen Reaktion mit 15 Zyklen PCR (dem Schritt mit begrenztem Zyklus) durchgeführt, gefolgt von einer Echtzeit-QRT-PCR. HCV-Belastungen wurden durch Real-Time PCR mit äußeren Primern KY78 und KY80 für Single-Round-Reaktionen (21) oder äußeren Primern plus inneren Primern hep21b und hep22 für verschachtelte Reaktionen mit begrenztem Zyklus (19) gemessen. Die Reaktionsmischungen enthielten 2 µl Fast Start DNA Master SYBR Green I (Roche), 4 mM MgCl2, eine 0,5 µM Konzentration jedes Primers und 2 µl des Templats in einem Gesamtvolumen von 20 µl. Nach Inkubationen für 10 min bei 95°C wurde die LightCycler PCR für 40 Zyklen durchgeführt, wobei jeder Zyklus aus 15 s bei 95°C, Annealing bei 60°C für 5 s und Extension bei 72°C für 10 s bestand. Die Fluoreszenz wurde bei 530 nm überwacht und die Spezifität des Signals durch Schmelzkurvenanalyse überprüft.

Mit synthetischer HCV-RNA als Template betrug die Sensitivität des Single-Round-Echtzeit-QRT-PCR-Assays bei Berechnung des Verdünnungsfaktors etwa 103 HCV-Kopien/ml oder 5 × 104 Kopien/ml. Es wurde eine breite lineare Beziehung (bis zu 6,5 × 108 Kopien / Reaktion) zwischen der Anzahl der zum Nachweis eines Fluoreszenzsignals erforderlichen PCR-Zyklen und der Anzahl der HCV-Kopien beobachtet. Wir haben die Serumviruslast von 24 Patienten gemessen, die chronisch mit verschiedenen in Australien vorherrschenden HCV-Genotypen infiziert waren (1a, 1b, 2a, 2b, 2c und 3a) (6). Drei Patienten hatten Viruslasten unterhalb der Sensitivität dieser Version des Assays (5 × 104 Kopien / ml), obwohl sie durch einen qualitativen Inhouse-verschachtelten RT-PCR-Assay positiv waren (19). Die verbleibenden 21 Patienten hatten Viruslasten im Bereich von 2,8 × 105 bis 9,1 × 106 Kopien / ml. Um die Sensitivität und Spezifität des Assays zu erhöhen, wurde eine 15-zyklische, einstufige RT-PCR mit anschließender quantitativer Echtzeit-PCR für die zweite Runde eingeführt. Mit synthetischer RNA konnte die modifizierte Methode einen weiten Bereich von HCV-Kopienzahlen (von 28 bis 2,8 × 106 HCV-Kopien / Reaktion) unter Beibehaltung der Linearität nachweisen. Die Sensitivität des verschachtelten QRT-PCR-Assays mit begrenztem Zyklus war größer als 28 Kopien / ml (oder 1.400 Kopien / ml), was ungefähr 40-fach größer war als die des Single-Round-QRT-PCR-Assays. Die Sensitivität dieses Assays ist im Vergleich zu den zuvor gemeldeten Methoden unter Verwendung der Echtzeitquantifizierung mit TaqMan-Technologie (Roche) und einem ABI Prism 7700-Sequenznachweissystem (Perkin-Elmer), die Sensitivitäten von 10 Kopien / Reaktion (9, 16) und 1.000 Kopien / Reaktion (12) gemeldet haben, günstig. Die Empfindlichkeit des Nachweises von LightCycler (Roche) und SYBR Green I wurde ebenfalls mit 10 Kopien/Reaktion angegeben (10). Um diese Version des Assays weiter zu validieren, wurden die Viruslasten von 16 HCV-positiven Serumproben, die von 1 × 103 bis 1 reichten, untersucht.es wurde gezeigt, dass 2 × 106 Kopien / ml (wie mit dem Amplicor Monitor Assay bestimmt) eng mit den Ergebnissen des verschachtelten Echtzeit-QRT-PCR-Assays korrelieren (r = 0,876, P < 0,0001, n = 16) (Abb. (Abb.11).

HCV repliziert sich in der Leber, aber nur wenige Studien haben versucht, die Viruslast in der Leber mit den klinischen Ergebnissen in Beziehung zu setzen, und ziehen es vor, den Vorhersagewert der Serumviruslast zu untersuchen. Letztere könnten als geeignetes Surrogat für hepatische Viruslasten angesehen werden, wenn gezeigt würde, dass sie korrelieren, aber nur wenige Studien haben dies gezeigt und die bisher berichteten Ergebnisse sind nicht überzeugend. Der verschachtelte QRT-PCR-Assay mit begrenztem Zyklus wurde daher zur Messung der hepatischen HCV-Belastung verwendet. Die für die Analyse verwendete Menge an Lebergewebe wog zwischen 0, 8 und 8, 1 mg (Mittelwert = 3.88 ± 2,1 mg), aus dem 2,1 bis 12,9 µg (Mittelwert = 6,62 ± 3,1 µg) RNA extrahiert wurden. Die Ausbeute an Gesamt-RNA betrug durchschnittlich 1,71 × 103 µg / g Lebergewebe, ein Wert ähnlich dem in einer früheren Studie von 1,01 × 103 µg RNA / g (13). Hepatische Viruslasten reichten von 3,0 × 102 bis 1,3 × 106 HCV-RNA-Moleküle / µg Gesamt-RNA, und der Durchschnitt betrug 2,38 × 105 ± 3,55 × 105 Kopien / µg RNA. Es wurde eine Korrelation zwischen den hepatischen Viruslasten, gemessen in Bezug auf die Anzahl der HCV-Kopien pro Mikrogramm Gesamt-RNA, und den mit dem Amplicor Monitor-Assay gemessenen Serumviruslasten nachgewiesen, obwohl diese schwach waren (r = 0, 417, n = 20) (13). Andere Studien haben gezeigt, dass die HCV-RNA-Belastung im Serum im Wesentlichen durch die Virusmenge in der Leber reflektiert wird, ohne Korrelationskoeffizienten bereitzustellen (3, 8). Hier berichten wir erstmals über eine statistisch signifikante Korrelation zwischen Leber- und Serumviruslastmessungen (r = 0,689, P = 0.004, n = 15), was darauf hinweist, dass der Grad der Virämie tatsächlich die in der Leber vorhandene Virusmenge widerspiegelt (Abb. (Abb.22).

In früheren Studien wurden Leberviruslastmessungen als Anzahl der Kopien pro Milligramm Lebergewebe oder als Anzahl der Kopien pro Mikrogramm Gesamt-RNA ausgedrückt. In dieser Studie zeigen wir, dass beide Einheiten geeignet zu sein scheinen, da eine signifikante Korrelation zwischen den Viruslasten, gemessen in Bezug auf die Anzahl der Kopien pro Milligramm Lebergewebe, und denen, gemessen als Anzahl der Kopien pro Mikrogramm Gesamt-RNA (r = 0,937, P < 0,0001, n = 20) (Abb. (Abb.3).3). Diese Ergebnisse stimmen mit denen von De Moliner et al. (3), die auch eine enge Korrelation zwischen der Viruslast in der Leber, ausgedrückt als Anzahl der Kopien pro Gramm Gewebe, und der Anzahl der Kopien pro Mikrogramm der gesamten zellulären RNA (r = 0, 85) (3). Die durchschnittliche Anzahl der HCV-RNA-Moleküle pro Gramm Lebergewebe betrug 2,1 × 108 ± 3,71 × 108, etwa 170-fach höher als die RNA-Spiegel im Serum (1,22 × 106 ± 2,0 × 106 Kopien / ml). Dieser Befund ähnelt dem von Terrault et al. (18), die zeigten, dass das Verhältnis von HCV-RNA in der Leber zu dem im Serum 103: 1 betrug. Im Gegensatz dazu McGuiness et al. (13) fanden heraus, dass der Spiegel im Lebergewebe um den Faktor > 104 größer war. Dieser Unterschied kann damit zusammenhängen, dass die hepatischen Viruslasten der Patienten der vorangegangenen Studie, die überwiegend eine fortgeschrittene HCV-Infektion aufwiesen, etwa achtfach höher waren (1,83 × 106 ± 0,75 × 106 Kopien/µg RNA) als die in der vorliegenden Studie erfassten (2,38 × 105 ± 3,55 × 105 Kopien/µg RNA).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Echtzeit-QRT-PCR-Assay eine empfindliche, genaue und zuverlässige Methode zur Überwachung der HCV-Belastung in Serum- und Leberproben ist.