A conceptual and practical overview of cDNA microarray technology: implications for basic and clinical sciences

Braz J Med Biol Res, October 2005, Volume 38(10) 1543-1552 (Review)

a conceptual and practical overview of cDNA microarray technology: implications for basic and clinical sciences

V. de Mello-Coelho ja K. L. Hess

Departamento de Histologia e Embriologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brasil

Abstrakti
teksti

vastaavuus ja alaviitteet

Abstrakti

cDNA microarray on innovatiivinen teknologia, joka helpottaa tuhansien geenien ilmentymisen analysointia samanaikaisesti. Tämän nopeasti kehittyvän menetelmän hyödyntäminen edellyttää biologisten, matemaattisten ja tilastotieteellisten tieteiden asiantuntemuksen yhdistämistä. Tässä katsauksessa pyrimme antamaan yleiskuvan cDNA microarray-teknologian periaatteista, saadun tiedon analyyttiseen käsittelyyn liittyvistä käytännön huolenaiheista, tämän menetelmän vastaavuudesta muiden data-analyysimenetelmien kanssa, kuten immunohistokemian kudosmikrojärjestelmissä, sekä cDNA microarray-sovelluksesta eri perus-ja kliinisten tieteiden alueilla.

avainsanat: Biotekniikka, cDNA mikroarray, geeniekspressio, genomiikka

Johdanto

geenit ovat perinnöllisiä yksiköitä, jotka muodostuvat deoksiribonukleiinihapon (DNA) sekvensseistä, jotka ovat järjestäytyneet solun tumassa oleviin kromosomeihin. Näiden sekvenssien monimutkainen transkriptioprosessi johtaa lähetti-ribonukleiinihappojen (mRNA) syntymiseen. Nämä mRNA-koodit koodaavat proteiineja, jotka koostuvat aminohapoista ja suorittavat geenin nimetyn tehtävän (1). Solujen ja kudosten rakenteelliset ja toiminnalliset ominaisuudet määräytyvät siis tuhansien geenien samanaikaisen, selektiivisen ja differentiaalisen ilmentymisen perusteella.

viime vuosikymmenestä lähtien tutkimukset, joihin liittyi geenien kartoitus, Kloonaus ja sekvensointi, ovat antaneet merkittävää tietoa eri genomien rakenteellisesta analyysistä (2,3). Näistä tutkimuksista saatujen tietojen määrä edellyttää hankittujen tietojen järjestämistä. Tämän tarpeen tyydyttämiseksi on luotu julkisia tietokantoja, joihin on tallennettu miljoonia geenisekvenssejä ja expressed sequences tageja (ESTs), jotka mahdollistavat liittymisen geenisekvensseihin eri lajien genomien yhtäläisyyksien ja erojen analysointia varten (4).

genomien Rakennetutkimukset ovat herättäneet lukuisia kysymyksiä liittyen eri eliöiden eri solutyypeissä ja kudoksissa esiintyvien geeniekspressioprofiilien funktionaaliseen ja säätelevään ymmärtämiseen (3,5,6). DNA microarray-tekniikka kehitettiin tutkimaan monimutkaista biologista käsittelyä, jossa oli mukana useita tuhansia geenejä (7,8). Yksi tällainen mikroarray-tekniikka käyttää yksittäisiä DNA-säikeitä tai-koettimia (oligomeerejä), jotka on painettu lasipinnalle fotolitografian avulla (9). Toinen DNA-mikroarray-menetelmä, joka on tämän tarkastelun kohteena, on täydentävä DNA (cDNA) – mikroarray-tekniikka (10). Näiden menetelmien avulla on mahdollista 1) vertailla samanaikaisesti tuhansien geenien dynaamista ilmentymämallia soluissa tai kudoksissa, 2) havaita molekyylieroja soluprosessien eri vaiheissa, esim.erilaistuminen, proliferaatio ja apoptoosin induktio, 3) tunnistaa transkriptioeroja sairaiden ja patologisten tilojen välillä, 4) tunnistaa lääkevasteesta johtuvat muutokset soluissa ja 5) tunnistaa uusia biomarkkereita, joita voidaan käyttää sairauksien diagnosoinnissa, ennusteessa ja kliinisessä hoidossa.

cDNA microarray-teknologian periaatteet

klassinen menetelmä, jota käytetään mRNA: n havaitsemiseen ja kvantifiointiin tietyssä solussa, on nimeltään Northern blot analysis (11). Northern blot-analyysin pääperiaate on radioleimatun geenispesifisen luotaimen risteyttäminen suodattimeen sitoutuneeseen mRNA: han, jotta voidaan selvittää, onko kyseinen geeni läsnä. Toinen menetelmä, jota käytetään tietyn geenin ilmentymisen havaitsemiseen, on käänteistranskriptiopolymeraasiketjureaktio (RT-PCR). RT-PCR: ssä käytetään geenispesifisiä alukkeita ja käänteiskopioijaentsyymiä syntetisoimaan cDNA-sekvenssi mRNA: han. Tämän jälkeen cDNA monistetaan tämän mallin cDNA: n (12) polymeraasivälitteisellä transkriptiolla. RT-PCR: ää on useita tyyppejä, ja kvantifioinnin kannalta tarkin on reaaliaikainen RT-PCR-menetelmä, joka edellyttää automaattista järjestelmää, joka pystyy havaitsemaan RT-PCR-reaktion aikana indusoidun fluoresenssin (12). RT-PCR: n aikana tietyn geenin ilmentyminen voidaan päätellä vertaamalla sitä konstitutiivisesti ilmaistuihin geeneihin, joita kutsutaan myös ”kodinhoitogeeneiksi”.

cDNA microarray-tekniikka, joka analysoi tuhansien geenien ilmentymistasoja samanaikaisesti, perustuu samoihin periaatteisiin kuin sekä Northern blot-että RT-PCR-analyysit (7,8). Pohjimmiltaan cDNA microarray on tuhansien geenien hybridisaatio cDNA: sta niiden vastaaviin kohteisiin sirulla tai suodattimella. Tämän teknologian nykyinen haaste on kuitenkin analysoida hybridisaatiosignaalien hankinnan kautta saatavan raa ’ an numeerisen tiedon huomattavia määriä (13). Laskennalliset ja biostatistiset analyysit ovat tarpeen, jotta merkittäviä tietoja voidaan käsitellä tarkasti tutkimuksen erityistavoitteiden kannalta (Kuva 1).

tuottamalla cDNA microarray matrix

viime aikoina useat yritykset ovat suunnitelleet cDNA microarrays keskittyneet tiettyihin geeniekspressioprofiilijärjestelmiin. Näitä matriiseja ovat kaupallisesti saatavilla bioteknologiayritykset, kuten SuperArray Bioscience Corporation ja Affymetrix, käytettäväksi kohtuuhintaan. Tässä jaksossa yritämme kuvata cDNA-mikroarray-matriisin tuotannon perusvaiheita.

ensimmäinen vaihe cDNA-mikroarray-matriisin tuottamiseksi on cDNA-sekvenssien kokonais-tai osittaisten fragmenttien valinta ja vahvistus, jotka painetaan substraateille ja jotka myöhemmin hybridisoidaan kohde-cDNA-sekvenssien kanssa (14,15). Yleisimmät menetelmät sekvenssien valitsemiseksi perustuvat seuraaviin resursseihin: 1) geenitietopankit, kuten Unigene, dbEST ja GenBank, jotka antavat tietoa tietyn geenin toiminnasta ja kromosomien lokalisoinnista; 2) kloonikokoelmat tai saatavilla olevat cDNA-sekvenssit kaupallisten yritysten kotisivuilla; 3) cDNA-kirjastojen räätälöidyt rakenteet kohdesolu-tai kudosaineistosta, joka on aiemmin kloonattu ja sekvensoitu EST-tunnistusta varten. Kun cDNA-fragmentit on valittu, ne vahvistetaan PCR: llä monivivahteisiin mikromuoveihin, puhdistetaan kemiallisella saostuksella ja tutkitaan sen jälkeen laadun ja määrän osalta geelielektroforeesillä. PCR-tuotteet tulostetaan liukumäelle tai kalvolle robottikoneella, microarrayerilla. DNA: n robottipainatuksen eli deposition aikana kapillaariputket saavat jatkuvan paineen ja tallettavat DNA: n sarjamaisesti liukumäelle tai kalvolle, jolloin syntyy ”mikroarray” – rakenne (16). Erityyppisiä substraatteja, kuten lasilevyjä ja nailonkalvoja esikäsitellään niiden hydrofobisten varausten lisäämiseksi, jolloin DNA-sekvenssien täydellinen kiinnittyminen substraatteihin lisääntyy (13). Mikä tärkeintä, tietojen indeksointi, joka sisältää tuhansien alustoille painettujen cDNA-kloonien sijainnin, suoritetaan kunkin mikrotason varovaisella merkinnällä käyttäen tietokantaanalyysiin suunniteltuja ohjelmistoja. Tämä tietokanta sisältää myös klooni identiteetti(klooni ID), geenin nimi, kromosomin sijainti, ja geenin toiminta (t).

cDNA-anturin hybridisaatio kohde-DNA: n mikroarray-matriisin kanssa

ratkaiseva tekijä cDNA-anturin onnistuneessa hybridisaatiossa kohde-DNA: n mikroarray-matriisiin riippuu soluista tai kudoksista peräisin olevan mRNA: n laadusta. Luotaimen RNA: n epäpuhtaudet genomisella DNA: lla, proteiineilla tai pesuainejäämillä voivat johtaa vääriin positiivisiin/vääriin negatiivisiin tietoihin.

luotaimen merkitseminen cDNA-synteesin aikana RNA-sekvenssien käänteiskopioinnilla riippuu käytettävän cDNA-mikroarrayn tyypistä (16). Yleensä kun cDNA-mikroarray-analyysiä tehdään käyttäen substraattina nailonkalvoja, koetin RNA merkitään radioaktiivisesti lisäämällä dctp-P33-nukleotideja käänteiskopiointiprosessin aikana (7). Lasilevyihin painetussa cDNA-mikroarrayssa käytetään radioaktiivisia nukleotideja (17) ja fluoresoivia väriaineita, joilla on korkea hyötysuhde, kuten syaniineja Cy-3 dUTP ja Cy-5 dutp (8). Lisätietoja cDNA-mikrorakenteiden tyypeistä ja hybridisaatioprosessista (7,8,17-20), ks.Taulukko 1.

cDNA microarray-tekniikalla

tuotettujen massiivisten tietomäärien analysointiin tarkoitettuja analyysityökaluja kehitetään edelleen. Tällä hetkellä tutkijat analysoivat cDNA microarray-dataa erilaisilla ohjelmistoilla (21-24). Tämä tarkoittaa, että ei ole olemassa yhtä menetelmää analysoida valtava määrä tietoa saadaan tällä tekniikalla. Biostatististen työkalujen käyttö on tullut yhä tärkeämmäksi analysoitaessa geenien ekspressioprofiilien merkitystä.

saadaksemme yleiskuvan joistakin menetelmistä, joita käytetään analysoimaan cDNA: n mikroarray-tietoja, kuvaamme ja keskustelemme vaiheista, jotka voivat haitata analysointiprosessia. Äärimmäisen tärkeää on tulosten validointi suorittamalla useita toistokokeita. Hybridisaatiosignaalien hankkimisen jälkeen substraatteja tutkitaan visuaalisesti laskennallisten ohjelmien avulla. Tällöin otetaan huomioon substraattien laatu. Esimerkiksi sumeat täpläkuvat, väriaine saostuu tai näytteet, joissa on voimakkaita taustasignaaleja, yleensä hylätään. Tämä analyysi on tärkeä artefaktien eliminoimiseksi, mikä voi johtaa väärien positiivisten signaalien havaitsemiseen (16). Eri tutkijat soveltavat hybridisaatiosignaalien taustavähennysmenetelmää taustalla oleviin epäspesifisiin signaaleihin. Tässä vaiheessa, riippuen käytetystä ohjelmistosta, on mahdollista vähentää taustasignaaleja seuraavilla kahdella tavalla: 1) substraatissa olevien pisteiden positiivisten signaalien välisen signaalin voimakkuuden aritmeettisella keskiarvolla tai mediaanilla, tai 2) epäspesifisen signaalin aritmeettisella keskiarvolla tai mediaanilla, kuten signaalin intensiteetillä, joka syntyy tiettyä geenisignaalia vastaavalta lähialueelta kunkin pisteen ympärillä. Näillä kahdella menetelmällä aritmeettinen keskiarvo tai mediaani vähennetään positiivisesta signaalista, joka edustaa eri tavoin ilmaistua geeniä (16). Positiivisen signaalin voimakkuuden hankkiminen tietyillä ohjelmistoilla luoduissa lokalisointiruudukoissa suoritetaan mielivaltaisissa arvoissa, joita kutsutaan algoritmeiksi. Näitä arvoja voidaan käyttää suoraan tietokantaohjelmistossa, joka sisältää aiemmin luetteloituja tietoja jokaisesta alustaan painetusta geenistä.

samanaikaisesti analysoitujen geenien valtavan määrän ja cDNA microarray-tekniikan kaikkien teknisten vaiheiden vaihtelun vuoksi on tärkeää luoda säätö-tai kompensaatiotekijä, joka tapahtuu tietojen normalisointiprosessin kautta. Epäspesifisten signaalien olemassaolo substraateilla, RNA: n määrään tai laatuun liittyvät ongelmat ennen hybridisaatiota tai RNA: n vaihtelu koettimen inkorporaatiossa voivat kaikki johtaa näytteen normalisoinnin heikkenemiseen (14,16). Jotta tietoja voitaisiin tulkita mielekkäämmin, normalisointiprosessi suorittaa vertailevan analyysin algoritmien aritmeettisesta keskiarvosta yksittäisestä ryhmästä toisen, usein valitun kontrollin kanssa (24,25). On olemassa useita erilaisia normalisointi menetelmiä ja valitsemalla sopivin menetelmä voi olla haaste. Syynä tähän on se, että useat kokeelliset muuttujat estävät usein eri tavoin ilmentyvien geenien tarkan tunnistamisen ilman, että väärät positiiviset/väärät negatiiviset tulokset sotkevat aineiston arviointia. CDNA microarray-teknologiassa matemaattinen, tilastollinen ja bioinformaattinen tuki on tässä vaiheessa kriittistä.

Normalisointimenetelmiä ovat: 1) eri ryhmien välisten mitattujen ekspressiotasojen logaritminen suhde, joka perustuu keskiarvoon, mediaaniin, mediaanieroihin tai varianssiin, joka on saatu kaikista substraateilla sijaitsevista positiivisista signaaleista; 2) regressioanalyysi, joka arvioidaan korrelaatiokertoimen tai Euklidiaanietäisyyden avulla ja joka perustuu saman ryhmän eri näytteiden signaalitehoja vastaavien algoritmien edustamaan jakaumaan, ja 3) tilastolliset testit, kuten t-testi tai assosiatiivinen analyysi, joissa tarkastellaan useita parivertailuja, jotka perustuvat P < 0,05: n merkittävään kynnysarvoon ja T-testin kynnysarvon merkitsevyyskorjaukseen (25,26). Lisäksi lowess-normalisointimenetelmä (locally weighted linear regression, lowess), jota käytetään usein fluoresoivissa matriiseissa, selittää intensiteettien hybridisaatiosignaalien vaihtelujen vähenemisen ja täplitetyn cDNA: n spatiaalisen sijainnin liukumäellä (27).

normalisoinnin jälkeen yksinkertaisin tapa tunnistaa erot geenien ilmentymismallien välillä on käyttää näytteen ja sen sopivan kontrollin välistä suhdeeroa. Tällöin asetetaan mielivaltainen raja, ja tästä arvosta on mahdollista valita eri tavoin ilmaistut geenit tietokantaohjelmiston avulla. On esimerkiksi mahdollista määrittää kaksikertainen kynnys tunnistaa geenit, joilla on merkittäviä muutoksia ilmentymistasossa. Tämän prosessin aikana tämän alueen geenit valitaan ja järjestetään tietokannassa oleviin taulukoihin. Valintakriteerit täyttävät geenit voidaan visualisoida tietokannoista itseorganisoituvia karttoja näyttävän ohjelmiston avulla (28,29). Lisäksi nämä muutokset eri ryhmien välisissä geeniekspressioprofiileissa voidaan visualisoida dendrogrameina hierarkkisen ryhmittelyanalyysin perusteella (25,29,30). Tällöin alaspäin säädellyt geenit näkyvät yleensä vihreinä ja ylös säädellyt geenit yleensä punaisina. Koska geenin säätelyero on voimakkaampi, niin on sen vastaava väri. CDNA microarray-tietojen analysointiin tarkoitetut ohjelmat ovat saatavilla Internetin kautta.

on tärkeää huomata, että cDNA microarray-teknologialla hankittujen geeniekspressioprofiilien analysointiin liittyy tuhansia geenejä, joita analysoidaan samanaikaisesti. Ennen tiettyjen geenien fysiologisia tutkimuksia cDNA-mikroarray-tulokset on vahvistettava RNA-tasolla Northern blot-analyysillä tai reaaliaikaisella RT-PCR-menetelmällä (14). Tämä eliminoi väärien positiivisten cDNA-mikroarray-tulosten mahdollisuuden, joka johtuu saman geeniperheen geenien risteytymisestä keskenään. Lisävahvistusta suositellaan myös proteiinitasolla, kuten Western blot-analyysillä, virtaussytometrialla tai immunohistokemialla. Tässä yhteydessä on tällä hetkellä mahdollista arvioida geenejä proteiinitasolla käyttäen kudosmikroarray-määrityksiä (31-33). Tissue microarray assay on menetelmä, jonka avulla voidaan arvioida jopa tuhat kudosta kerralla käyttämällä tiettyä merkkiainetta. Periaatteessa pieni ydin koepaloja 1 mm tai vähemmän eristetään yksittäisten parafiini-upotettu kudoslohkoja erityisellä metallinen laite tai neula, ja sijoitetaan toiseen parafiini lohko arrayed tavalla. Edut tämän tekniikan ovat: 1) taloudellisuus ja säilyttäminen alkuperäisen kudosnäytteiden saatu biopsia rakentaa array; 2) teknisten ongelmien välttämiseksi, koska array on rakennettu yhteen lasilevyyn, mikä helpottaa pesua ja värjäystä teknisissä prosesseissa, ja 3) nopeus suorittaa in situ-analyysi samanaikaisesti useissa kudosnäytteissä kerralla. Kliinisesti se on tehokas tekniikka, jota käytetään yhdessä cDNA: n mikroarray-analyysin kanssa uusien biomarkkereiden tunnistamiseksi, joita voidaan käyttää diagnostisina, ennustavina ja terapeuttisina välineinä patologisia tiloja vastaan (31,32).

cDNA microarray technology: sovellukset ja näkökulmat

sovelluksen kannalta cDNA microarray-teknologia johtaa tiettyjen geenien tunnistamiseen ja antaa tutkijoille mahdollisuuden verrata geenien ilmentymisen profiileja normaaleissa ja patologisissa olosuhteissa eri organismeissa. Perustieteessä cDNA-mikroarrayta on käytetty useiden solujen prosesseihin, kuten solujen erilaistumiseen, osallistuvien geenien roolin selvittämiseen vertailemalla geenien ilmentymismalleja normaalien ja transfektoitujen soluviljelmien välillä, esimerkiksi (34). Monet tutkimusryhmät ovat käyttäneet cDNA microarray-teknologiaa erilaisten syöpätyyppien sekä tartuntatautien (35-40) patogeneesin tutkimiseen. Tässä tapauksessa uusien geenien tunnistaminen tai muutokset geenien ilmentymismalleissa kudoksissa ei-sairaasta sairaaseen tilaan on auttanut ymmärtämään paremmin sairauksien puhkeamista ja etenemistä sääteleviä molekyylimekanismeja. Lisäksi cDNA microarrayta on pidetty hyvin mielenkiintoisena menetelmänä lääketeollisuudessa. Tässä yhteydessä geenin ekspressioprofiilin analysoinnilla suuressa mittakaavassa eri huumetesteihin toimitetuissa soluissa voisi olla merkitystä luokiteltaessa mahdollisia lääkeaineita terapeuttiseen käyttöön (41). Taulukossa 2 on esitetty useita esimerkkejä cDNA microarray-menetelmän soveltamisesta perus-ja kliinisiin tieteisiin (34-48).

cDNA microarray-analyysi on kallis menetelmä, mutta tästä teknologiasta saatujen tulosten runsaus on kiistaton voitto. Kun tämän menetelmän kehittämistä varten on perustettu keskusyksikkö, eri tutkijat voivat hyödyntää aiemmin painettuja cDNA-mikroarray-substraatteja tutkiakseen erilaisia geenejä sekä biologisilla että kliinisillä alueilla. CDNA-mikroarray-yksiköiden järjestämisessä on otettava huomioon matemaattisten ja biologisten areenoiden monitieteinen vuorovaikutus. Yksinkertainen hypoteettinen kaavamalli, joka osoittaa cDNA: n mikroarray-yksikön infrastruktuurin, esitetään kuvassa 2.

lopuksi on luotu keskitetyt pankit, jotka sisältävät cDNA microarray-teknologialla analysoitujen geeniekspressioprofiilien tietoja ja jotka ovat tarkastettavissa Internetin kautta (49,50). Tällä tavoin eri ryhmät eri puolilla maailmaa voivat vertailla valittujen geeniprofiilien tietoja muihin molekyylitietopankkeihin, kuten geeniekspressio Omnibus tai Array Express, jonka on suunnitellut Euroopan bioinformatiikan instituutti (51).

ongelma, joka on rajoittanut hyödyllistä vuorovaikutusta cDNA microarray-tekniikkaa käyttävien eri tutkimusryhmien välillä, on tulosten esittämistä ja vaihtamista koskevien standardien puute. Tämän ahdingon kompensoimiseksi luotiin Minimitiedot Mikroarray-kokeen (MIAME) merkintää varten (52). CDNA: n microarray-kokeiden standardisointiin johtavia ohjeita on ehdottanut Micro-array Gene Expression Data Society (mbed). MIAME koostuu periaatteessa kuudesta osasta: 1) kokeellinen suunnittelu; 2) array suunnittelu; 3) käytetyt näytteet, uutevalmisteet ja hybridisaatio; 4) hybridisaation menettelyt ja parametrit; 5) kuva -, kvantifiointi-ja parametrimittaus ja 6) tyypit, arvot ja eritelmät normalisointiohjauksille. MIAMESTA on tullut vaatimus julkaista cDNA microarray-tuloksia monissa tieteellisissä lehdissä. Lisäksi erilliset ryhmät kuten MGED, Rosetta, Agilent ja Affymetrix ovat työskennelleet yhdessä bioinformatiikan avulla suunnitellakseen mikroarray-geeniekspression (MAGE), joka on yhteinen joustava rakennealusta, joka mahdollistaa viestinnän eri tutkimusryhmien välillä cDNA microarray-tekniikalla. MAGE koostuu seuraavista: 1) MAGE-ON (object model), keskitetty tietomalli, joka käyttää yhtenäistä mallinnuskieltä ja toteuttaa MIAME-vaatimukset; 2) MAGE-ML (markup language), joka dokumentoi kääntämisen MAGE-OM: sta XML-pohjaiseen dataformaattiin, ja 3) MAGE-SLK, vapaasti käytettävissä oleva ohjelmisto, joka määrittelee SOVELLUSOHJELMOIJIEN rajapinnan MAGE-OM: iin, mikä mahdollistaa datan viennin MAGE-ML: lle ja johtaa datan tallentamiseen relaatiotietokantaan (53).

viime aikoina nanoteknologiaa on sovellettu laajasti eri areenoilla, kuten teollisuudessa, lääketeollisuudessa ja valtion sovelluksissa, nykyaikaisen tieteellisen edistyksen parantamiseksi. Nanohiukkasten ainutlaatuisten fysikaalisten ja kemiallisten ominaisuuksien vuoksi näillä materiaaleilla on kyky parantaa aistinvaraisia laitteita, työntövoiman lisäaineita, kudosten muokkaustekniikoita ja huumeiden kohdentamismekanismeja. Lisäksi nanoteknologiaa on hyödynnetty mikroarray-taitojen parantamisessa (54) ja proteiininanorakenteiden kehittämisessä (55). Laboratorioympäristössä tutkijat alkavat nyt tutkia nanohiukkasten mahdollisia positiivisia/negatiivisia vaikutuksia geenien induktioon/estoon soluissa käyttämällä mikroarray-tekniikkaa (56). Lopuksi nanoteknologian ja mikroarray-teknologian yhdistäminen on jopa edistänyt nykytietämystä geeneistä, joita säädellään eri tavoin tautiprosessien aikana (57,58).

yhdessä nämä työkalut voivat auttaa ymmärtämään uusia geenitoimintoja eri genomeissa ja sitä, miten ne korreloivat ihmisten sairauksien patogeneesin kanssa. CDNA microarray-teknologian kehittäminen ja soveltaminen ovat tuoneet paljon edistystä lääkkeiden löytämiseen, tutkimusdiagnostiikkaan ja mahdollisiin geeniterapioihin, jotka on tarkoitettu erilaisten sairauksien hoitoon. Tämä perusteknologia auttaa tutkijoita ymmärtämään moninaisiin ja moninaisiin biologisiin prosesseihin liittyviä molekyylimekanismeja.

9. Sengupta R & Tompa M (2002). Laadunvalvonta valmistuksessa oligo taulukot: kombinatorisista suunnittelu lähestymistapa. Journal of Computational Biology, 9: 1-22.

11. Alwine JC, Kemp DJ & Stark GR (1977). Menetelmä spesifisten RNAs: ien osoittamiseksi agaroosigeeleissä siirtämällä ne diatsobentsyylioksimetyylipaperiin ja hybridisoimalla DNA-koettimien kanssa. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 74: 5350-5354.

12. Bustin A (2000). MRNA: n absoluuttinen kvantifiointi reaaliaikaisilla käänteistranskriptiopolymeraasiketjureaktiomäärityksillä. Journal of Molecular Endocrinology, 25: 169-193.

17. Whitney LW & Becker KG (2001). Radioaktiiviset 33-P-luotaimet hybridisoituvat lasisiin cDNA-mikrorakenteisiin hermokudosten avulla. Journal of Neuroscience Methods, 106: 9-13.

19. Shalon D, Smith SJ & Brown PO (1996). DNA-mikroarray-järjestelmä monimutkaisten DNA-näytteiden analysointiin kaksivärisellä fluoresoivalla luotaimen hybridisaatiolla. Genome Research, 6: 639-645.

20. Bertucci F, Bernard K, Loriod B et al. (1999). Herkkyysongelmat DNA-matriisiin perustuvissa ilmaisumittauksissa ja nailonmikrarakenteiden suorituskyvyssä pieniä näytteitä varten. Human Molecular Genetics, 8: 1715-1722.

22. Kerr mk & Churchill GA (2001). Bootstrapping cluster analysis: microarray-kokeiden johtopäätösten luotettavuuden arviointi. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 98: 8961-8965.

23. Planet PJ, Desalle R, Sidall m et al. (2001). Systemaattinen analysis of DNA microarray data: order and interpreting patterns of gene expression. Genome Research, 11: 1149-1155.

24. Tanaka TS, Jaradat SA, Lim MK ym. (2000). Genominlaajuinen ilmentymä profilointi raskauden puolivälin istukan ja alkion käyttäen 15000 hiiren kehityshäiriöitä cDNA mikroarray. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 97: 9127-9132.

25. Quackenbush J (2001). Computational analysis of microarray data. Nature Genetics, 2: 418-427.

27. Yang YH, Dudoit S, Luu P et al. (2002). Normalisointi cDNA microarray data: vankka komposiitti menetelmä käsitellään yhden ja usean dian systemaattinen vaihtelu. Nucleic Acids Research, 30: e15.

28. Tamayo P, Slonim D, Mesirov J et al. (1999). Interpreting patterns of gene expression with self-organizing maps: methods and application to hematopoietic differentation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 96: 2907-2912.

30. Eisen MB, Spellman PT, Brown po et al. (1998). Klusterianalyysi ja genomin laajuisten ilmentymäkuvioiden esittely. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 95: 14863-14868.

31. Braunschweig T, Chung JY & Hewitt SM (2004). Perspectives in tissue microarrays. Kombinatorial Chemistry and High Transformput Screening, 7: 575-585.

34. Tseng YH, Butte AJ, Kokkotou E et al. (2005). Preadiposyyttien erilaistumisen ennustaminen geeniekspression avulla paljastaa insuliinireseptorisubstraattien ja necdinin roolin. Nature Cell Biology, 7: 601-611.

36. Staudt LM (2001). Gene expression fysiologia ja patofysiologia immuunijärjestelmän. Trends in Immunology, 22: 35-40.

37. Berns A (2000). Geeniekspressio diagnoosissa. Nature, 403: 491-492.

38. Sawiris GP, Sherman-baust CA, Becker KG et al. (2002). Kehittäminen pitkälle erikoistunut cDNA array tutkimukseen ja diagnosointiin epiteelin munasarjasyövän. Cancer Research, 62: 2923-2928.

39. Khan J, Wei JS, Ringner m et al. (2001). Syöpien luokittelu ja diagnostinen ennustaminen geeniekspressioprofiloinnin ja keinotekoisten neuroverkkojen avulla. Nature Medicine, 7: 673-679.

40. Chang JC, Hilsenbeck SG & Fuqua SA (2005). Genomiset lähestymistavat rintasyövän hoidossa ja hoidossa. British Journal of Cancer, 92: 618-624.

41. Lovett RA (2000). Toxicogenomics. Toksikologit varautuvat genomiikan vallankumoukseen. Science, 289: 536-537.

42. Flores-Morales A, Stahlberg N, Tollet-Egnell P ym. (2001). Mikroarray-analyysi hypofysektomian ja kasvuhormonihoidon in vivo vaikutuksista rotan geeniekspressioon. Endocrinology, 142: 3163-3176.

43. Liu K, Li Y, Prabhu V et al. (2001). Aktivaation indusoimien geenien ilmentymisen lisääminen erottaa muistin naiiveista CD4+ T-soluista ja on molekyylimekanismi muistin CD4+ T-solujen soluvasteen tehostamiseksi. Journal of Immunology, 166: 7335-7344.

44. Hess K, Yang Y, Golech s et al. (2004). Kineettinen arviointi geeniekspression muutoksista ihmisen naiivin CD4+ T-solun aktivaation aikana. International Immunology, 16: 1711-1721.

46. Hacia JG, Fan JB, Ryder O et al. (1999). Esi – alleelien määrittäminen ihmisen yksinukleotidipolymorfismeille käyttäen suuritiheyksisiä oligonukleotidiryhmiä. Nature Genetics, 22: 164-167.

49. Miles M (2001). Microarray: lost in a storm of data? Nature Neuroscience, 2: 441-443.

50. Becker KG (2001). CDNA microarray-datan jakaminen. Nature Neuroscience, 2: 438-440.

54. Wang X, Jiang n, Feng X et al. (2003). Uudenlainen lähestymistapa korkealaatuiseen microarray-käsittelyyn kolmannen väriaineen visualisointitekniikalla. IEEE Transactions on Nanobioscience, 2: 193-201.

56. Berry CC, Charles s, Wells s et al. (2004). Stabiloitujen magneettisten nanohiukkasten siirtämisen vaikutus ihmisen ihon fibroblasteihin viljelmässä. International Journal of Pharmaceutics, 269: 211-225.

57. Crnic I & Christofori G (2004). Uudet teknologiat ja viimeaikaiset edistysaskeleet etäpesäkkeiden tutkimuksessa. International Journal of Developmental Biology, 48: 573-581.

kirjeenvaihto ja alaviitteet