Braz J Med Biol Res, toukokuu 2004, Volume 37(5) 625-634
käänteiskopio-PCR: n käyttö X-linkitetyn kroonisen granulomatoottisen taudin
P. Agudelo-Flórez1, J. A. López1, J. Redher1, M. M. S. Carneiro-Sampaio2, B. T. Costa-Carvalho3, A. S. Grumach4 ja A. Condino-Neto1
1centro de Investigação em Pediatria, and the Departments of Pediatrics and Pharmacology, Faculty of Medical Sciences, State University of Campinas, Campinas, SP, Brasilia
2departamento of Immunology, Institute of biolääketieteen Sciences, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasilia.
3dlikina of Allergy, Immunology and Rheumatology, Department of Pediatrics, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP, Brasilia.
4Laboratório lääketieteellinen tutkimus 56, dermatologian laitos, Lääketieteellinen tiedekunta,, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil
Abstrakti Johdanto potilaat ja menetelmät tulokset Keskustelu kuittaukset
vastaavuus ja alaviitteet
Abstrakti 
krooninen granulomatoottinen sairaus (CGD) on synnynnäinen immuunijärjestelmän sairaus, jolle on ominaista fagosyyttien hapetuspurkaus ja siitä seuraava niiden mikrobisidisen aktiivisuuden heikkeneminen. Mutaatiot yhdessä NADPH-oksidaasikomponentissa vaikuttavat tämän järjestelmän geeniekspressioon tai toimintaan, mikä johtaa CGD: n fenotyyppiin. Viat gp91-phox johtaa X-linkitetty CGD, vastuussa noin 70% CGD tapauksissa. CGD-potilaiden erittäin heterogeenisen genotyypin tutkimus sisältää mutaatioanalyysin, Northern blot-tai Western blot-määritykset erityistapauksen mukaan. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli käyttää käänteistä transkriptiota (RT)-PCR: ää analysoitaessa molekulaarisia vikoja, jotka aiheuttavat X-linkitetyn CGD: n kahdeksalla brasilialaisella potilaalla, ja arvioida sen mahdollisuuksia laajempaan soveltamiseen CGD: n molekyyliseulontaan. Kokonais-RNA valmistettiin Epstein B-viruksen muuntamista B-lymfosyyteistä ja käänteiskopioitiin satunnaisilla heksameereillä. Tuloksena saatu cDNA oli PCR-monistettu spesifisillä ja päällekkäisillä primer-pareilla, jotka oli suunniteltu vahvistamaan gp91-phox-geenin kolmea aluetta: eksoneja 1-5, 3-9 ja 7-13. Tämä strategia havaitsi viallisen gp91-phox-ilmaisun seitsemällä potilaalla. RT-PCR-tulokset vastasivat kliinistä historiaa, biokemiallisia tietoja (nitroblue tetratsolium-tai superoksidipäästömääritys) ja käytettävissä olevaa mutaatioanalyysiä neljässä tapauksessa. Kolmessa muussa tapauksessa RT-PCR-tulokset vastasivat kliinistä historiaa ja biokemiallisia tietoja. Toisessa tapauksessa RT-PCR oli normaali huolimatta CGD: n kanssa yhteensopivasta kliinisestä taustasta ja viallisesta hengityspurkauksesta. Johtopäätöksemme on, että tämä RT-PCR – analyysin Uusi soveltaminen – yksinkertainen, taloudellinen ja nopea menetelmä-sopi molekyylivirheiden seulontaan 7: llä 8: sta X-linkitetystä CGD-potilaasta.
avainsanat: superoksidi, fagosyytit, primaarinen immuunipuutos, hengityspurkaus, neutrofiilit, ihmisen
Johdanto
krooninen granulomatoottinen sairaus (CGD) on primaarinen immuunipuutos, joka alun perin kuvattiin vuonna 1957 kliinisenä kokonaisuutena, joka vaikuttaa poikalapsiin ja nimettiin tuolloin lapsuusiän kuolemaan johtavaksi granulomatoottiseksi sairaudeksi. CGD: n tärkeimmät ominaisuudet ovat toistuvat ja vakavat infektiot, joihin liittyy eliön luonnollisia esteitä, kuten hengitysteitä ja imusolmukkeita, ja lopulta sisärakenteet, kuten maksa, perna, luut ja aivot (1-3). Tämän harvinaisen taudin arvioitu esiintyvyys on 1/250, 000 elävänä syntynyttä vuodessa. Infektioita aiheuttavat yleensä katalaasinegatiiviset bakteerit, kuten Staphylococcus aureus, Gramnegatiiviset basillit ja sienilajit, kuten Aspergillus, Candida ja Nocardia (4,5).
NADPH-oksidaasijärjestelmä tuottaa superoksidia ja muita reaktiivisia hapenvälittäjiä, jotka ovat tärkeitä fagosyyttien mikrobisidisen aktiivisuuden kannalta. CGD: n biokemiallinen vika on NADPH-oksidaasin aktiivisuuden heikkeneminen ja siitä seuraava kyvyttömyys tuhota mikro-organismeja (6). NADPH-oksidaasijärjestelmän pääkomponentit ovat gp91-, p22-, p47-, p67-ja p40-phox. CGD: tä aiheuttavat molekyylivirheet johtuvat yleensä jonkin NADPH-oksidaasikomponentin puuttumisesta, vähäisestä ilmentymisestä tai toimintahäiriöstä. Tämän taudin X-linkittynyt muoto johtuu vioista gp91-phoxissa, sytokromi b588: n raskaassa ketjussa, ja sen osuus on noin 70% kaikista tapauksista (7,8). Autosomaalisesti resessiiviset muodot johtuvat vioista yhdessä NADPH-oksidaasin sytosolisessa komponentissa (p47 – tai p67-phox, vastaavasti 20 ja 5%: ssa tapauksista) tai sytokromi b588: n kevyessä ketjukomponentissa (P22-phox, 5%: ssa tapauksista) (9,10). CGD on erittäin heterogeeninen tila: kansainvälisesti ylläpidettyyn X-CGD-tietokantaan on rekisteröity yli 300 mutaatiota (8). Mutaatiot ovat jakautuneet suurelta osin gp91-phox (CYBB) – geenin 13 eksonin sisällä tai eksonin/intronin rajoilla, ja lähes 200 näistä mutaatioista on ainutlaatuisia.
CGD: n diagnoosi perustuu yleensä taudin kliinisiin ominaisuuksiin ja puutteelliseen NADPH-oksidaasiaktiivisuuteen, joka on osoitettu epänormaaleilla nitroblue-tetratsoliumilla (NBT), dihydrorhodamiini 123: lla tai superoksidin vapautumiskokeilla (11,12). Stimuloidussa NBT-testissä normaaleilla yksilöillä on lähes 100% positiivisia soluja, kun taas CGD-potilailla alle 5% soluista on positiivisia (13). Lisäksi CGD-varianttia sairastavien potilaiden solut ovat positiivisia, mutta niissä on vain hyvin alhainen aktiivisuus (6). NBT-testi tunnistaa myös X-linkitetyn CGD: n kantajat (äidit ja sisaret). Lopullinen CGD-molekylaarinen diagnoosi tehdään potilailla, joilla on epänormaali NBT-testi tai hengityspurkausaktiivisuus ja joilla on jokin seuraavista ominaisuuksista: gp91-, p22-, p47-tai p67-phox-mutaatio; mRNA puuttuu yhdeltä näistä geeneistä, jotka on todettu Northern blot-analyysillä; ja/tai proteiini puuttuu yhdeltä näistä oksidaasikomponenteista Western blot-menetelmällä. Geneettinen, mutta ei molekulaarinen diagnoosi voidaan vahvistaa osoittamalla äidin serkkuja, setiä tai veljenpoikia epänormaalilla NBT-testillä tai hengityspurkauksella (14). Näin ollen tämän harvinaisen ja erittäin heterogeenisen taudin lopullisen diagnoosin tekeminen edellyttää monimutkaisia ja kalliita menetelmiä, kuten yhdistelmä Pohjoista blotia tai Western blotia ja yksijuosteinen konformaatiopolymorfismianalyysi (SSCP), jota seuraa useiden perheenjäsenten DNA-sekvensointi, jotka kaikki suoritetaan erittäin monimutkaisissa tutkimuslaboratorioissa.
käänteiskopio-PCR (RT-PCR) – menetelmässä cDNA monistetaan PCR: llä. Tämä tekniikka voidaan helposti standardoida vähemmän kehittyneissä laboratorioissa. Se tarjoaa tietoa geenien ilmentymisestä ja alustavia tietoja viallisen komponentin mRNA: n rakenteesta tai koosta. RT-PCR: ää on harvoin käytetty CGD-tutkimuksessa, ja se on rajoittunut patofysiologisiin tutkimuksiin (15-29). Tähän mennessä ei ole laajasti tutkittu tämän hyödyllisen välineen mahdollista käyttöä X-linkitetyn CGD: n, joka on yleisin muoto, lopullisen diagnoosin määrittämiseksi. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida RT-PCR: n käyttöä X-linkitetyn CGD: n, harvinaisen ja mahdollisesti väärin diagnosoidun immuunipuutoksen, molekyylivirheiden seulonnassa kahdeksalla brasilialaisella potilaalla.
potilaat ja menetelmät
potilaat
potilaat
tutkimukseen osallistui 8 asiaan liittymätöntä brasilialaista miespotilasta, joilla oli todennäköinen X-yhteys CGD: hen (2 mustaa ja 6 valkoihoista; ikä 2-8 vuotta; pituus 88-108 cm; Paino 11-19 kg). Potilailla oli kliinistä historiaa toistuvista vaikeista infektioista, kuten keuhkokuumeesta, lymfadeniitista, maksan paiseesta, pyodermitistä ja BCG-immunisaatioon liittyvistä haittavaikutuksista. Heidät ohjattiin laboratorioomme biokemiallista ja molekyylidiagnostista arviointia varten. Osallistujilta saatiin kirjallinen tietoon perustuva suostumus ennen tutkimusta. Lääketieteellisen tiedekunnan eettinen komitea hyväksyi pöytäkirjan Helsingin yleissopimuksen ja Brasilian terveysministeriön päätöslauselman 196/96 mukaisesti.
CGD: n biokemiallinen diagnoosi
CGD: n biokemiallinen diagnoosi vahvistettiin Pan American Group for Immunodeficiencies criteria-ryhmän mukaan. NADPH-oksidaasiaktiivisuuden heikkeneminen osoitettiin perifeerisen veren neutrofiilien ja mononukleaaristen leukosyyttien (14,30,31) NBT-diakokeella ja/tai superoksidianionin vapautumiskokeella. Neutrofiilit ja mononukleaariset leukosyytit saatiin sentrifugoimalla verinäytteitä Ficoll-Hypaque-tiheysgradientin yli (32).
NBT-diakoe perustui aktivoitujen leukosyyttien (31) aiheuttamaan NBT: n pelkistämiseen formatsaaniksi. Määritys tehtiin edellä kuvatulla tavalla (30). Yli 95% 200 normaalista neutrofiilistä, jotka on stimuloitu 30 nM: llä Forbol-12-myristaatti-13-asetaatilla (PMA), pitäisi pystyä vähentämään NBT: tä. Puuttuvan reaktion tai <5% positiivisia soluja katsottiin viittaavan CGD-diagnoosiin (14).
neutrofiilien ja mononukleaaristen leukosyyttien aiheuttama kvantitatiivinen superoksidipäästö arvioitiin modifioidulla superoksididismutaasia estävällä sytokromi c: n pelkistysmäärityksellä (33-35). Vapautuvan superoksidin määrä laskettiin käyttämällä sytokromi c: lle ekstinktiokerrointa 0,21 nM/cm. tulokset ilmoitetaan nmol-superoksidina, jota vapautuu 106 solua tunnissa. CGD-potilaiden kontrolliarvot olivat alle 10%.
seulonta-molekyylivirheet, jotka aiheuttivat X-linkitetyn CGD: n
X-linkitetyn CGD: n potilaiden B-lymfosyytit muunnettiin in vitro Epstein B-viruksella (EBV) (15,16), jotta voitiin tarjota runsas nukleiinihappolähde molekyylitutkimuksissa. EBV: n muuntamat B-solulinjat toistavat CGD-potilaiden biokemiallisia ja molekyylivirheitä (15,16,36) ja poistavat toistuvien verikokoelmien tarpeen. Lyhytaikaisesti X-linkitettyjen CGD-potilaiden perifeerisen veren leukosyyttejä viljeltiin supernatanteilla B95-8: sta, EBV: n tuottajasolulinjasta (15,16,36,37), rpmi 1640-elatusaineesta, jota täydennettiin lämpö inaktivoidulla naudan sikiön seerumilla (10%), 2 mM L-glutamiinilla, 100 U/ml penisilliinillä ja 100 µg/ml streptomysiiniä 37ºC: ssa kosteassa ilmakehässä, jossa 5% CO2. Solujen elävyyttä seurattiin ja viljelmiä säilytettiin koko tutkimusjakson ajan.
RNA-näytteet EBV: n muuntamista B-solulinjoista valmistettiin guanidiini HCl-menetelmällä, minkä jälkeen etanoli saostettiin ja kvantifioitiin standardimenetelmillä (38,39). CDNA-näytteet saatiin käänteiskopioimalla 2 µg kokonais-RNA: ta SuperScript II RT: llä (GIBCO BRL) ja satunnaisilla heksameereillä (15). MRNA-näytteiden laatu tarkastettiin β-aktiinin, konstitutiivisen geenikontrollin (BP 920-943 ja bp 1494-1471) PCR-amplifikaatiolla (Gen Bank accession No. NM001101).
gp91-phox-geenin ilmentymistä arvioi RT-PCR. Erityiset ja päällekkäiset paria primers (Gen Pankki liittyminen nro. Nm_000397, Taulukko 1) käytettiin vahvistamaan (30 sykliä) kolmea gp91-Fox-eksonialuetta: 1-5, 3-9 ja 7-13. Tämän strategian ansiosta pystyimme seulomaan kaikki gp91-phox-eksonit. PCR-tuotteet analysoitiin 2% agaroosigeelielektroforeesilla ja värjättiin etidiumbromidilla.
suhteellinen gp91-phox-geeniekspressio analysoitiin Image Master-ohjelmistolla (Pharmacia-Biotech). Kohdenäytteiden densitometrian tulos jaettiin konstitutiivisen geenikontrollin ß-aktiinin densitometrian tuloksella, joka normalisoi analyysissä huomioon otetun tason. RT-PCR-määritysten tuloksia verrattiin potilaan kliiniseen historiaan, biokemiallisiin määrityksiin (NBT ja/tai superoksidin vapautumismääritys) ja saatavilla oleviin mutaatioanalyysitietoihin (http://www.sbi.org.br/Sbi2003/ indeksi.htm).
tulokset
tutkimme 8 miespotilasta, joilla oli kliinistä historiaa toistuvista vakavista infektioista, ja lähetimme laboratoriomme CGD: n biokemiallista ja molekyylidiagnostiikkaa varten. NBT-diatestien ja superoksidipäästömääritysten tulokset esitetään taulukossa 2. Kuudella potilaalla todettiin alle 5% positiivisia leukosyyttejä NBT-diatestissä. Kuudella potilaalla todettiin granulosyyttien ja/tai mononukleaaristen leukosyyttien superoksidin vapautumisen heikentymistä (alle 10% verrattuna terveisiin verrokkiryhmiin). Neljällä potilaalla oli molemmissa testeissä poikkeavia tuloksia. Kaikille potilaille tehtiin vähintään yksi poikkeava testi ja heille diagnosoitiin todennäköinen X-linkitetty CGD. Potilaan äiti ja sisar esittivät NBT-diatestin, joka on yhteensopiva X-linkitetyn CGD: n kantajastatuksen kanssa. Tutkimusjakson aikana yksi potilas (G. M.) kuoli keuhkokuumeeseen.
seuraavaksi tutkimme X-linkitetyn CGD: n lopullista diagnoosia RT-PCR-analyysillä gp91-phox-geenin ilmentymisestä. RT-PCR-vahvistuksen tulokset, joissa on kolme päällekkäistä aluketta, on esitetty taulukossa 2. MRNA-näytteen laatu tarkastettiin β-aktiinin, konstitutiivisen geenikontrollin, PCR-monistuksella. Tässä tapauksessa saatiin odotetut normaalit tuotteet (Kuvat 1, 2 ja 3).
neljässä tapauksessa RT-PCR-tiedot voitiin yhdistää saatavilla olevaan mutaatioanalyysiin, jonka esittivät muualla Patiño et al. (30) tai ryhmämme (//www.sbi.org.br/Sbi2003/index.htm): J. E. M. esitti c469®t-transition exon 5: ssä ennustaen nonsense-mutaation (R157X). MF esitti nonsense-substituution ekson 3: ssa, R (arginiini) 73-Stop: ssä. R. S. osoitti 264 g®a-substituution gp91-phox exon 3: n 3′ – liitoskohdassa. CDNA: n sekvenssi osoitti gp91-phox exon 3: n poiston, jolloin syntyi epävakaa tai toimimaton mutantti gp91-phox. G. G. gp91-phox exon 3: n liitos oli viallinen (taustalla olevaa mutaatiota ei ole vielä määritetty). Muiden potilaiden tutkimukset jatkuvat.
kokonaisuutena tämä strategia mahdollisti puutteellisen gp91-phox-ilmentymän havaitsemisen seitsemällä potilaalla kahdeksasta. RT-PCR-tulokset vastasivat neljässä tapauksessa kliinistä historiaa, biokemiallisia tietoja (NBT tai superoksidin vapautumismääritys) ja saatavilla olevaa mutaatioanalyysiä. Kolmessa muussa tapauksessa RT-PCR-tulokset vastasivat kliinistä historiaa ja biokemiallisia tietoja. Toisessa tapauksessa RT-PCR oli normaali huolimatta CGD: n kanssa yhteensopivasta kliinisestä historiasta, viallisesta hengityspurkauksesta, jolle on ominaista NBT-testi ja superoksidin vapautusmääritys ja hänen äitinsä ja sisarensa NBT-testit, jotka ovat yhteensopivia X-linkitetyn CGD-kantajan tilan kanssa.
Keskustelu
tässä asiakirjassa kerrotaan biokemiallisista ja geeniekspressiotutkimuksista 8: lla asiaan liittymättömällä brasilialaisella miespotilaalla, joilla oli CGD: n kliininen historia ja jotka lähetettiin laboratorioomme tarkempia tutkimuksia varten. CGD on harvinainen perinnöllinen sairaus, jossa fagosyyttisolut eivät kykene tuottamaan superoksidianionia ja muita reaktiivisia hapenvälittäjiä. Alun perin määritimme todennäköisen X-linkitetyn CGD: n diagnoosin biokemiallisilla menetelmillä, kuten NBT-diakokeilla ja/tai superoksidi-anionien vapautustesteillä. Tuloksemme osoittivat, että kaikilla potilailla oli heikentynyt NADPH-oksidaasin toiminta ja vuorostaan todennäköinen X-linkitetty CGD.
molemmat menetelmät vaikuttavat CGD: n todennäköiseen diagnosointiin eri tavoin. NBT-liukutestillä saadaan tietoa NBT: tä formatsaaniksi pelkistävien solujen määrästä sytoplasman sisällä ja tämän pelkistymisen voimakkuudesta. Siten potilaat, joilla on X-linkitetyn CGD: n varianttimuotoja, osoittavat epänormaaleja NBT-diatestejä, joissa suurin osa soluista pelkistää NBT: n heikosti formatsaaniksi. NBT-liukutesti havaitsee myös X-linkitetyn CGD: n naispuoliset kantajat. Superoksidinvapautusmääritys mittaa sytokromi c: n pelkistymistä reaktiossa esiintyvien aktivoitujen leukosyyttien tuottamalla superoksidilla, mikä mahdollistaa X-linkitetyn CGD: n muunnosmuotojen diagnosoinnin. Molemmat testit voidaan helposti standardoida matalan kompleksisuuden laboratorioissa, eikä kumpikaan vaadi kalliita laitteita. Dihydrorhodamiini 123-testi on erittäin herkkä menetelmä CGD: n biokemialliseen diagnoosiin; se vaatii kuitenkin virtaussytometrin, joka on erittäin kallis väline.
arvioimme RT-PCR-analyysillä GP91-phox-geenin ilmentymistä CGD-potilaiden EBV-transformoiduissa B-lymfosyyteissä. Erityisiä ja päällekkäisiä alukepareja käytettiin vahvistamaan kolmea GP91-phox-geenin aluetta RT-PCR: llä: eksonit 1-5, 3-9 ja 7-13. Tämä strategia mahdollisti viallisen gp91-phox-ilmaisun havaitsemisen 7 potilaalla 8: sta. RT-PCR-tulokset vastasivat neljässä tapauksessa kliinistä historiaa, biokemiallisia tietoja (NBT tai superoksidin vapautumismääritys) ja saatavilla olevaa mutaatioanalyysiä. Kolmessa muussa tapauksessa RT-PCR-tulokset vastasivat kliinistä historiaa ja biokemiallisia tietoja.
gp91-phox-geenin ekspressio väheni kaikilla potilaan RB: n eksonisilla alueilla.väheneminen voi johtua mutaatioista, jotka johtavat alhaiseen RNA-stabiiliuteen tai muuttuneeseen transkriptiotoimintaan. Potilaat G. M. ja T. P. osoitti eksonien 7-13 puuttuvan ilmentymän, mikä viittaa siihen, että näiden 3′-loppuisten ylimääräisten eksonien vähentynyt ilmentyminen voi johtua RNA: n epävakaudesta tai silmukointivirheestä, esim.osittain oikeasta liitoksesta signaalin tuottamiseksi, mutta osittain epänormaalista liitoksesta primeerisitoutumiskohdan poistamiseksi, jota tutkitaan tulevilla genomisilla DNA-mutaatioanalyyseillä.
potilas G. G. esitti eksonien 1-5 diffuusia, vähäistä runsautta, pienikokoisempaa tuotetta (Kuva 1) ja muiden eksonialueiden puuttuvaa ilmentymistä. Mutaatioanalyysi osoitti vian exon 3: n liitoskohdassa. Samoin potilaan RS: n mutaatioanalyysi paljasti vian myös exon 3: n liitoskohdassa. Tässä tapauksessa voitiin kuitenkin havaita vähemmän runsasta PCR-tuotetta.
potilas M. F. esitti eksonialueiden 3-9 ja 7-13 heikentyneen ilmentymän, mikä voi johtua ekson 3: n puutteellisesta transkriptiotoiminnasta. J. E. M. esitti ekson 5: ssä nonsense-mutaation, joka johti GP91-phox-ekspression menetykseen, kuten RT-PCR-analyysi osoittaa, mikä on mahdollinen seuraus nonsense-välitteisestä mRNA-epävakaudesta.
yhdessä tapauksessa potilaan TPB., gp91-phox geenin ilmentyminen oli normaalia huolimatta suvussa yhteensopiva CGD ja viallinen hengitys räjähtää toimintaa. Tässä tapauksessa todennäköisen X-linkitetyn CGD: n diagnoosi perustui hänen äitinsä ja sisarensa epänormaaleihin NBT-testeihin, jotka olivat yhteensopivia kantajan statuksen kanssa. Oletamme, että pistemutaatio, kuten yksittäinen emässubstituutio, joka ei muuta PCR-fragmenttien pituutta tai runsautta, tulisi tutkia tässä nimenomaisessa tapauksessa.
RT-PCR on tehokas työkalu geenin ilmentymisen arviointiin. Tämä ominaisuus saattaa osittain selittää gp91-phox-geenin ekspression vaihtelun tähän tutkimukseen osallistuneilla potilailla ja sen, miten tärkeää on yhdistää päällekkäiset alukeparit viestin koko pituuden seulomiseksi. RT-PCR: ää on käytetty yksittäistapaustutkimuksissa osana CGD: n eri muotojen (17-22) alustavaa diagnoosia. RT-PCR-analyysi oli hyödyllinen myös P47-phox-puutoksesta (23) johtuvan CGD: n synnytystä edeltävässä diagnoosissa. Yleisemmin sitä on kuitenkin käytetty NADPH-oksidaasikomponenttien geenisäätelyn tutkimiseen eri soluissa (15,16,24-29). Tähän mennessä tämän hyödyllisen välineen mahdollista käyttöä X-linkitetyn CGD: n, joka on yleisin muoto, lopullisen diagnoosin määrittämiseksi ei ole tutkittu laajasti. Lisätutkimuksia on tehtävä, jotta tämän testin herkkyyttä ja spesifisyyttä voidaan verrata muihin monimutkaisiin määrityksiin, kuten läntisiin tai pohjoisiin blotteihin.
kaiken kaikkiaan olemme osoittaneet, että RT-PCR, yksinkertainen ja edullinen menetelmä, vahvistettu lopullinen diagnoosi X-linkitetty CGD 7 8 tapauksessa, ilman tarvetta käyttää monimutkaisia ja kalliita menetelmiä, kuten Northern blot, slot blot, SSCP analyysi, tai genomiset DNA sekvensointi. RT-PCR voi siis olla sopiva väline CGD: n diagnosointiin kehitysmaiden laboratorioissa. On erittäin tärkeää määrittää lopullinen molekulaarinen geenivirhe, jotta voidaan tarjota asianmukainen geneettinen neuvonta ja ennuste kindreds CGD. Lisäksi ihmisen NADPH-oksidaasijärjestelmän molekyyligeneettiset tutkimukset edistävät tietoa tästä ratkaisevasta ja ikivanhasta puolustusmekanismista.
2. Landing BH & Shirkey HS (1957). Toistuvan infektion ja sisäelinten infiltraation oireyhtymä pigmentoituneiden lipidihistiosyyttien toimesta. Pediatrics, 20: 431-442.
3. Patterson EL, Milstrey R & Stokstad ELR (1975). Seleenin vaikutus estettäessä eksudatiivista diathesis poikasilla. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 95: 617-620.
5. Forrest CB, Forehand JR, Axtell RA, Roberts rl & Johnston Jr RB (1988). Kroonisen granulomatoottisen taudin kliiniset ominaisuudet ja nykyinen hoito. Hematology/Oncology Clinics of North America, 2: 253-266.
6. Curnutte JT (1993). Krooninen granulomatoottinen sairaus: kliinisen arvoituksen ratkaiseminen molekyylitasolla. Clinical Immunology and Immunopathology, 67: S2-S15.
7. Dinauer MC, Orkin SH, Brown R, Jesaitis AJ & Parkos CA (1987). X-linkitetyn kroonisen granulomatoottisen taudin lokuksen koodaama glykoproteiini on osa neutrofiilien sytokromi b-kompleksia. Nature, 327: 717-720.
9. Clark RA, Malech HL, Gallin JI, Nunoi H, Volpp BD, Pearson DW, Nauseef WM & Curnutte JT (1989). Kroonisen granulomatoottisen taudin geneettiset muunnokset: NADPH-oksidaasijärjestelmän kahden sytosolikomponentin puutteiden esiintyvyys. New England Journal of Medicine, 321: 647-652.
10. Cross AR, Noack D, Rae J, Curnutte JT & Heyworth PG (2000). Hematologisesti tärkeät mutaatiot: autosomaalinen resessiivinen muotoja krooninen granulomatoottinen tauti (ensimmäinen päivitys). Blood Cells, Molecules and Diseases, 26: 561-565.
11. Smith RM & Curnutte JT (1991). Kroonisen granulomatoottisen taudin molekyylipohjainen perusta. Blood, 77: 673-686.
12. Vokaalit SJ, Fleisher TA, Sekhsaria S, Alling DW, Maguire TE & Malech HL (1996). Genotyypistä riippuva vaihtelu nikotiiniamidiadeniinidinukleotidifosfaattioksidaasin toiminnan heikkenemisen virtaussytometrisessä arvioinnissa kroonista granulomatoottista sairautta sairastavilla potilailla. Journal of Pediatrics, 128: 104-107.
15. Condino-Neto a & Newburger PE (1998). Ihmisen Epstein-Barr-viruksen muuntamien B-lymfosyyttien NADPH-oksidaasiaktiivisuus ja sytokromi b558-pitoisuus korreloivat oksidaasijärjestelmän komponentteja koodaavien geenien ilmentymisen kanssa. Archives of Biochemistry and Biofysics, 360: 158-164.
16. Condino-Neto a & Newburger PE (2000). Gammainterferoni tehostaa CYBB-geenitranskriptien liittämistä interferoniherkkään X-linkitetyn kroonisen granulomatoottisen taudin muunnokseen, joka johtuu liitoskohdan konsensusalueen mutaatiosta. Blood, 95: 3548-3554.
19. Bonizzato A, Russo MP, Donini M & Dusi S (1997). Kaksoismutaation (D160V-K161E) tunnistaminen kroonista granulomatoottista sairautta sairastavan potilaan p67phox-geenissä. Biochemical and Biofysical Research Communications, 231: 861-863.
21. Noack D, Heyworth PG, Newburger PE & Cross AR (2001). Epätavallinen introninen mutaatio CYBB-geenissä, joka aiheuttaa kroonisen granulomatoottisen taudin. Biochimica et Biophysica Acta, 1537: 125-131.
22. Roesler J, Curnutte JT, Rae J, Barrett D, Patino P, Chanock SJ & Goerlach A (2000). Rekombinaatiotapahtumat P47-phox-geenin ja sen erittäin homologisen pseudogeenin välillä ovat autosomaalisesti resessiivisesti resessiivisen kroonisen granulomatoottisen sairauden pääsyy. Blood, 95: 2150-2156.
23. De Boer M, Singh V, Dekker J, Di Rocco M, Goldblatt D & Roos D (2002). Prenataalinen diagnoosi kahdessa perheessä, joilla on autosomaalinen, P47 (phox)-puutteellinen krooninen granulomatoottinen sairaus, joka johtuu ncf1: n uudesta pistemutaatiosta. Raskausdiagnoosi, 22: 235-240.
24. Baehner RL, Millar-Groff s & Bringas P (1999). NADPH: n fagosyyttisten oksidaasikomponenttien kehityksellinen ilmentyminen hiiren alkioissa. Pediatric Research, 46: 152-157.
25. Banerjee R, Anguita J, Roos D & Fikrig E (2000). Cutting edge: infektio aineen ihmisen granulosytic ehrlichiosis estää hengitysteiden puhkeamista alas-säätelevä gp91phox. Journal of Immunology, 164: 3946-3949.
26. Bayraktutan U, Blayney l & Shah AM (2000). Nad(P)H-oksidaasikomponenttien gp91-Fox ja p22-Fox molekyylien karakterisointi ja lokalisointi endoteelisoluissa. Arterioskleroosi, tromboosi ja verisuonten biologia, 20: 1903-1911.
27. Cobbs S, Malech HL, Leto TL, Freeman SM, Blaese RM, Gallin JI & Lomax KJ (1992). Rekombinantti p47fox-proteiinin retroviraalinen ilmentymä Epstein-Barr-viruksen muuntamissa B-lymfosyyteissä autosomaalisessa kroonisessa granulomatoottisessa sairaudessa. Blood, 79: 1829-1835.
28. Gorlach A, Brandes RP, Nguyen K, Amidi M, Dehghani F & Busse R (2000). Endoteelisoluissa selektiivisesti ilmaistua NADPH-oksidaasia sisältävä GP91FOX on tärkeä happiradikaalin muodostuksen lähde valtimon seinämässä. Circulation Research, 87: 26-32.
29. Rouzaut a, Lopez-Moratalla n & de Miguel C (2000). Differentiaalinen geeniekspressio ihmisen monosyyttien aktivoinnissa ja kypsymisessä. Archives of Biochemistry and Biofysics, 374: 153-160.
31. Ochs HD & Igo RP (1973). NBT-diatesti: yksinkertainen seulontamenetelmä kroonisen granulomatoottisen taudin ja naiskantajien havaitsemiseksi. Journal of Pediatrics, 83: 77-82.
32. Boyum A (1968). Mononukleaaristen solujen ja granulosyyttien eristäminen ihmisen verestä. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation, 21 (Suppl 97): 1-77.
33. Condino-Neto A, Muscara MN, Grumach AS, Carneiro-Sampaio MMS & de Nucci G (1993). Kroonista granulomatoottista tautia sairastavien potilaiden neutrofiilit ja mononukleaarisolut vapauttavat typpioksidia. British Journal of Clinical Pharmacology, 35: 485-490.
35. Condino-Neto A, Muscara MN, Grumach AS, Bellinati-Pires R, Brandao AC, Carneiro-Sampaio MMS & de Nucci G (1996). Ihmisen gammainterferoni-interferonin vaikutus neutrofiilien ja mononukleaarisolujen typpioksidin vapautumiseen kroonista granulomatoottista tautia sairastavilla potilailla. Journal of Interferon and Cytokine Research, 16: 357-364.
36. Volkman DJ, Buescher ES, Gallin ji & Fauci AS (1984). B-solulinjat perittyjen fagosyyttisten sairauksien malleina: superoksidisukupolvi kroonisessa granulomatoottisessa sairaudessa ja rakeet Chediak-Higashin oireyhtymässä. Journal of Immunology, 133: 3006-3009.
37. Nilsson K, Klein G, Helle W & Helle G (1971). Lymfoblastoidisolulinjojen perustaminen aikuisen ja sikiön ihmisen imukudoksesta ja sen riippuvuus EBV: stä. International Journal of Cancer, 8: 443-450.
39. Subrahmanyam YVBK, Baskaran N, Newburger PE & Weissman SM (1999). A modified method for the display of 3 ’ – end restriciton fragments of cDNAs: Molecular profiling of gene expression in neutrofiils. Methods in Enzymology, 303: 272-297.
kiitokset
kirjoittajat kiittävät potilaita ja heidän omaisiaan osallistumisesta ja avusta sekä hoitaja Silvana Severinoa teknisestä avusta. Kirjoittajat kiittävät myös professori Peter Newburgeria Massachusettsin yliopiston lääketieteellisestä tiedekunnasta tämän käsikirjoituksen kriittisestä tarkastelusta.
kirjeenvaihto ja alaviitteet