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Quantification de l’ARN du VHC.

Le but de cette étude était de développer un test QRT-PCR simple et en temps réel pour la quantification de l’ARN du VHC dans des échantillons de sérum et de foie avec détection SYBR Green I plutôt que l’utilisation de sondes marquées. Des essais QRT-PCR en temps réel ont été réalisés avec un LightCycler (Roche) avec une amplification à un tour et une nouvelle amplification imbriquée à cycle limité. Des étalons d’ARN ont été transcrits avec la polymérase T7 à partir d’amplicons dérivés de produits PCR de région 5′ non traduits clonés en pGEM-T Easy (Promega) et traités deux fois avec la DNase RQ1. L’ARN a été quantifié par spectrophotométrie. Pour la quantification en un seul tour d’échantillons de sérum, l’ARN a été transcrit inverse comme décrit précédemment (7). Pour la quantification par PCR imbriquée à cycle limité, une RT-PCR a été réalisée dans une réaction en une étape avec 15 cycles de PCR (l’étape à cycle limité), suivie d’une QRT-PCR en temps réel. Les charges de VHC ont été mesurées par PCR en temps réel avec des amorces externes KY78 et KY80 pour les réactions à un tour (21) ou des amorces externes plus des amorces internes hep21b et hep22 pour les réactions imbriquées à cycle limité (19). Les mélanges réactionnels comprenaient 2 µl de Fast Start DNA Master SYBR Green I (Roche), 4 mm MgCl2, une concentration de 0,5 µM de chaque amorce et 2 µl de la matrice dans un volume total de 20 µl. Après 10 min d’incubation à 95°C, la PCR du LightCycler a été réalisée pendant 40 cycles, chaque cycle comprenant 15 s à 95°C, un recuit à 60°C pendant 5 s et une extension à 72°C pendant 10 s. La fluorescence a été surveillée à 530 nm et la spécificité du signal a été vérifiée par analyse de la courbe de fusion.

Avec l’ARN de VHC synthétique comme matrice, la sensibilité du test QRT-PCR en temps réel à un tour était d’environ 103 copies de VHC/ réaction ou 5 × 104 copies/ml lorsque le facteur de dilution a été calculé. Une grande relation linéaire a été observée (jusqu’à 6,5 × 108 copies / réaction) entre le nombre de cycles de PCR nécessaires pour détecter un signal de fluorescence et le nombre de copies de VHC. Nous avons mesuré les charges virales sériques de 24 patients infectés de manière chronique par divers génotypes du VHC répandus en Australie (1a, 1b, 2a, 2b, 2c et 3a) (6). Trois patients présentaient des charges virales inférieures à la sensibilité de cette version du test (5 × 104 copies/ml), bien qu’elles aient été positives par un test qualitatif de RT-PCR imbriqué en interne (19). Les 21 patients restants présentaient des charges virales allant de 2,8 × 105 à 9,1 × 106 copies / ml. Pour augmenter la sensibilité et la spécificité du test, une RT-PCR en une étape à 15 cycles a été introduite avec une PCR quantitative en temps réel ultérieure pour le deuxième cycle. Avec l’ARN synthétique, la méthode modifiée a pu détecter une large gamme de nombres de copies du VHC (de 28 à 2,8 × 106 copies / réaction du VHC) tout en maintenant la linéarité. La sensibilité du test QRT-PCR imbriqué à cycle limité était supérieure à 28 copies / réaction (ou 1 400 copies / ml), ce qui était environ 40 fois supérieur à celui du test QRT-PCR à un tour. La sensibilité de ce test se compare favorablement à celles des méthodes précédemment rapportées utilisant la quantification en temps réel avec la technologie TaqMan (Roche) et un système de détection de séquence ABI Prism 7700 (Perkin-Elmer), qui ont rapporté des sensibilités de 10 copies / réaction (9, 16) et 1000 copies / réaction (12). La sensibilité de la détection de LightCycler (Roche) et de SYBR Green I a également été rapportée à 10 copies / réaction (10). Pour valider davantage cette version du test, les charges virales de 16 échantillons de sérum positifs au VHC, qui variaient de 1 × 103 à 1.2 × 106 copies / ml (telles que déterminées avec le test Amplicor Monitor), ont montré une corrélation étroite avec les résultats obtenus avec le test QRT-PCR imbriqué en temps réel (r = 0,876, P < 0,0001, n = 16) (Fig. (Figue.11).

Le VHC se reproduit dans le foie, mais peu d’études ont tenté de relier les charges virales dans le foie aux résultats cliniques, préférant examiner la valeur prédictive des charges virales sériques. Ce dernier pourrait être considéré comme un substitut approprié pour les charges virales hépatiques s’il s’avérait qu’elles étaient corrélées, mais peu d’études l’ont montré et les résultats rapportés à ce jour ne sont pas convaincants. Le test QRT-PCR imbriqué à cycle limité a donc été utilisé pour mesurer les charges hépatiques de VHC. La quantité de tissu hépatique utilisée pour l’analyse pesait entre 0,8 et 8,1 mg (moyenne = 3.88 ± 2,1 mg), dont on a extrait 2,1 à 12,9 µg (moyenne = 6,62 ± 3,1 µg) d’ARN. Le rendement en ARN total était en moyenne de 1,71 × 103 µg/g de tissu hépatique, une valeur similaire à celle trouvée dans une étude antérieure de 1,01 × 103 µg d’ARN/g (13). Les charges virales hépatiques variaient de 3,0 × 102 à 1,3 × 106 molécules d’ARN du VHC/ µg d’ARN total, et la moyenne était de 2,38 × 105 ± 3,55 × 105 copies/µg d’ARN. Une corrélation a été démontrée entre les charges virales hépatiques, mesurées en termes de nombre de copies de VHC par microgramme d’ARN total, et les charges virales sériques mesurées avec le test Amplicor Monitor, bien qu’elles soient faibles (r = 0,417, n = 20) (13). D’autres études ont montré que la charge d’ARN du VHC dans le sérum est sensiblement reflétée par la quantité de virus dans le foie sans fournir de coefficients de corrélation (3, 8). Ici, nous rapportons pour la première fois une corrélation statistiquement significative entre les mesures de la charge virale hépatique et sérique (r = 0,689, P = 0.004, n = 15), indiquant que le taux de virémie reflète en fait la quantité de virus présente dans le foie (Fig. (Figue.22).

Dans des études antérieures, les mesures de la charge virale hépatique ont été exprimées en nombre de copies par milligramme de tissu hépatique ou en nombre de copies par microgramme d’ARN total. Dans cette étude, nous montrons que l’une ou l’autre unité semble convenir, car il existe une corrélation significative entre les charges virales mesurées en nombre de copies par milligramme de tissu hépatique et celles mesurées en nombre de copies par microgramme d’ARN total (r = 0,937, P < 0,0001, n = 20) (Fig. (Figue.3).3). Ces résultats concordent avec ceux de De Moliner et al. (3), qui a également démontré une corrélation étroite entre la charge virale dans le foie, exprimée en nombre de copies par gramme de tissu, et le nombre de copies par microgramme d’ARN cellulaire total (r = 0,85) (3). Le nombre moyen de molécules d’ARN du VHC par gramme de tissu hépatique était de 2,1 × 108 ± 3,71 × 108, soit environ 170 fois plus élevé que les taux d’ARN dans le sérum (1,22 × 106 ± 2,0 × 106 copies/ml). Cette conclusion est similaire à celle de Terrault et al. (18), qui a montré que le rapport entre l’ARN du VHC dans le foie et celui du sérum était de 103:1. En revanche, McGuiness et coll. (13) ont constaté que le taux dans le tissu hépatique était supérieur d’un facteur > 104. Cette différence peut être liée au fait que les charges virales hépatiques des patients de l’étude précédente, qui présentaient principalement une infection avancée par le VHC, étaient environ huit fois plus élevées (1,83 × 106 ± 0,75 × 106 copies / µg d’ARN) que celles enregistrées dans la présente étude (2,38 × 105 ± 3,55 × 105 copies / µg d’ARN).

En conclusion, le test QRT-PCR en temps réel est une méthode sensible, précise et fiable pour surveiller les charges de VHC dans les échantillons de sérum et de foie.