ELISA: a kísérleti eredmények elemzése

Dr. Surat P, Ph.D. felülvizsgálta Dr. Tomislav Me Approvi, MD, Ph. D.

az ELISA vagy enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálat olyan eszköz, amelyet anyagok, például peptidek, fehérjék, antitestek és hormonok kimutatására és mennyiségi meghatározására használnak. Ez magában foglalja egy antigén vagy antitest immobilizálását egy felületre, majd egy elemzendő minta hozzáadását. A detektálás egy specifikus antigén-antitest reakciótól függ.

Jarun Ontakrai |

Mi a teendő az ELISA futtatása előtt

az ELISA-tesztet mindig ismétlésekben (duplikátumokban vagy triplikátumokban) kell elvégezni, hogy elegendő számú mintát érjenek el ahhoz, hogy kiszámítsák az ELISA szórását és együtthatóját variáció. A hiba együtthatót 20% – nál kisebbnek kell tartani. Ha a számított hiba nagy, akkor a pipettázásból, a lemezek és reagensek szennyeződéséből, a párolgásból és/vagy a hőmérsékletből eredő hibákat ki kell értékelni.

Standard görbe

a minta koncentrációjának mérésére standard görbét használunk. Először a standard koncentrációk (pg/ml) abszorbanciaértékeit ábrázoljuk. Negatív görbét is készítenek, amely nem tartalmaz szabványos mintaadatokat, és a háttérzaj észlelésére és mérésére szolgál. A pontos méréshez ezt a háttérértéket le kell vonni a standard görbéből.

az ismert koncentráció abszorbanciaértékei pozitív kontrollként ábrázolhatók. A célfehérje koncentrációját úgy kapjuk meg, hogy először kiszámítjuk az átlagos abszorbanciát, majd a standard görbe segítségével becsüljük meg a koncentrációt.

hígítási tényezőket is figyelembe kell venni. Például, ha a mintát négyszeresére hígítottuk, akkor az abszorbanciát meg kell szorozni néggyel, mielőtt a standard görbét használnánk a koncentráció kiszámításához.

variációs koefficiens

a variációs koefficiens meghatározása a szórás és az átlag aránya, azaz a standard deviáció/átlag (6638). A variációs együttható nagy értékei pontatlanságokat jeleznek a kutak közötti pipettázás vagy reagensek keverése, bakteriális vagy gombás szennyeződés, a kutak kiszáradása vagy a hőmérséklet-ingadozások miatt.

tüske visszanyerés

az ELISA-teszt futtatása után kapott érték attól függ, hogy a célzott fehérje hogyan lép kölcsönhatásba az antitestekkel, és ezt a kölcsönhatást összehasonlítják egy standard fehérje görbével. Számos tényező – beleértve a puffert, a mátrixot és a heterofil antitesteket-befolyásolhatja a minta kötődését, ezért ezt figyelembe kell venni az ELISA pontosságának meghatározásakor.

az ELISA-eredmények pontosságának meghatározására tüske-vizsgálatot lehet végezni. Ebben a vizsgálatban ismert mennyiségű rekombináns fehérjét adunk a mintához vagy adunk hozzá. Ezután a standard görbe segítségével megmérjük az anyag mennyiségét. A mért értékek nagy eltérései hibákat jelezhetnek a vizsgálat ismeretlen elemei miatt.

linearitási vizsgálat

linearitási vizsgálatot is használnak az ELISA pontosságának meghatározására. Ebben az esetben a’ tüskés mintát ‘ sorozatosan 1:2, 1:4 és 1:8 arányban hígítjuk. Ha a módosított minta koncentrációját észlelik, és az eredmények nem mutatnak lineáris változást a mérésekben, az az ELISA pontosságának hibáira utalhat.

egyes esetekben bizonyos koncentrációknál hibák figyelhetők meg, alacsonyabb koncentrációknál pedig már nem. Ilyen esetekben előfordulhat, hogy a mintát hígítani kell a koncentrációmérések elvégzése előtt.

hibaelhárítás

a háttérzajt számos tényező okozhatja, többek között:

• a kutak elégtelen mosása
• szennyezett mosópufferek
• túl sok detektáló reagens
• az antitest Keresztreaktivitása
• a puffer és/vagy az analit kicsapódása

néha rossz standard görbe keletkezhet. Ennek oka lehet a standard oldat hibái, a standard lebomlása, a standard nem megfelelő feloldása, vagy ha a görbe nem felel meg a skálának. Ez utóbbit figyelembe véve a rajzolás különböző skálákkal végezhető el, például log-log vagy 5 paraméter logisztikai görbe.

további adatok

• minden enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálat (ELISA) tartalom
• ELISA Alkalmazások
• Western Blot-Lab a fehérjék kimutatására használt technika
• antitest Alkalmazások
• génexpresszió mérése

írta:

Dr. Surat P

Dr. Surat PhD fokozatot szerzett. sejtbiológia és Mechanobiológia a Tata alapkutatási Intézetben (Mumbai, India) 2016-ban. Ph. D. előtt Surat a Bachelor of Science (B.Sc.) Állattani diploma, amelynek során az Indiai Tudományos Akadémia nyári ösztöndíjában részesült az AIDs-ben részt vevő fehérjék tanulmányozására. Számos témakörben készít cikkeket, mint például az orvosi etika, az adatok manipulálása, az áltudomány és a babona, az oktatás és az emberi evolúció. Szenvedélyesen foglalkozik a tudományos kommunikációval,és cikkeket ír az élettudományok minden területére.

Idézetek