PMC

HCV RNS mennyiségi meghatározásával.

a vizsgálat célja egy egyszerű, valós idejű QRT-PCR vizsgálat kidolgozása volt a HCV RNS mennyiségi meghatározására mind a szérumban, mind a májmintákban SYBR Green I detektálással, nem pedig jelölt próbák alkalmazásával. A valós idejű QRT-PCR vizsgálatokat Lightcyclerrel (Roche) végeztük, mind egy körös amplifikációval, mind egy új, korlátozott ciklusú beágyazott amplifikációval. Az RNS-standardokat T7 polimerázzal transzkripáltuk 5′ nem transzlált régió PCR termékeiből származó amplikonokból, amelyeket pgem-T Easy (Promega) – ba klónoztunk, és kétszer kezeltünk RQ1 DNase-zel. Az RNS-t spektrofotometriával számszerűsítettük. A szérumminták egyfordulós mennyiségi meghatározásához az RNS-t a korábban leírtak szerint reverz transzkripcióval írtuk le (7). A korlátozott ciklusú beágyazott PCR kvantifikációhoz RT-PCR-t végeztünk egylépéses reakcióban 15 PCR-ciklussal (a korlátozott ciklusú lépés), majd valós idejű QRT-PCR-rel. A HCV-terheléseket valós idejű PCR-rel mértük KY78 és KY80 külső primerekkel egykörös reakciók esetén (21) vagy külső primerekkel plusz hep21b és hep22 belső primerekkel korlátozott ciklusú beágyazott reakciók esetén (19). A reakcióelegyekben 2 db gyorsindítású DNS Master SYBR Green I (Roche), 4 mM-es MgCl2, minden egyes primer 0,5 km-es koncentrációja, és 2 db sablon 20 km-es Össztérfogata volt. Inkubációkat követően 10 percig 95 6CC-n, a LightCycler PCR-t 40 cikluson keresztül hajtottuk végre, mindegyik ciklus 15 S-ból állt 95 oC-n, lágyítás 60 oc-n 5 s-On, meghosszabbítás 72 oc-n 10 s-On. A fluoreszcenciát 530 nm-en monitoroztuk, a jel specifitását olvadásgörbe analízissel ellenőriztük.

szintetikus HCV RNS mint sablon esetén az egyfordulós valós idejű QRT-PCR vizsgálat érzékenysége körülbelül 103 HCV kópia/reakció volt, vagy 5 604 kópia/ml volt a hígítási tényező kiszámításakor. A fluoreszcens jel kimutatásához szükséges PCR-ciklusok száma és a HCV-kópia száma között széles lineáris összefüggést figyeltek meg (6,5 608 kópia/reakcióig). 24, Ausztráliában elterjedt HCV genotípussal (1a, 1b, 2a, 2b, 2c és 3a) krónikusan fertőzött beteg szérum vírusterhelését mértük (6). Három betegnél a vírusterhelés a vizsgálat ezen változatának érzékenysége alatt volt (5 db 104 kópia/ml), bár kvalitatív házon belüli beágyazott RT-PCR vizsgálattal pozitívak voltak (19). A fennmaradó 21 beteg vírusterhelése 2,8 605-9, 1 106 kópia/ml volt. A vizsgálat érzékenységének és specifikusságának növelése érdekében egy 15 ciklusú, egylépéses RT-PCR-t vezettünk be, majd a második körben egy valós idejű kvantitatív PCR-t vezettünk be. Szintetikus RNS-sel a módosított módszer képes volt a HCV kópiaszámok széles skáláját kimutatni (28-tól 2,8-ig) 606 HCV kópia/reakció), miközben fenntartotta a linearitást. A korlátozott ciklusú beágyazott QRT-PCR vizsgálat érzékenysége nagyobb volt, mint 28 kópia/reakció (vagy 1400 kópia/ml), ami körülbelül 40-szer nagyobb volt, mint az egykörös QRT-PCR vizsgálaté. Ennek a vizsgálatnak az érzékenysége kedvezően hasonlítható össze a TaqMan technológiával (Roche) és az ABI Prism 7700 szekvencia detektáló rendszerrel (Perkin-Elmer) végzett valós idejű kvantálást alkalmazó, korábban jelentett módszerekkel, amelyek 10 kópia/reakció (9, 16) és 1000 kópia/reakció (12) érzékenységét jelentették. A LightCycler (Roche) és a SYBR Green I detektálás érzékenysége szintén 10 kópia/reakció volt (10). A vizsgálat ezen változatának további validálásához a vírusterhelés 16 HCV-pozitív szérumminták, amelyek között mozgott 1 603-1.2 6 6 kópia / ml (az Amplicor Monitor vizsgálattal meghatározottak szerint) szoros korrelációt mutatott a beágyazott valós idejű QRT-PCR vizsgálattal kapott eredményekkel (r= 0,876, P < 0,0001, n = 16) (ábra. (Ábra.11).

a HCV replikálódik a májban, mégis kevés tanulmány próbálta összekapcsolni a máj vírusterhelését a klinikai eredményekkel, inkább a szérum vírusterhelés prediktív értékét vizsgálja. Ez utóbbi a máj vírusterhelésének megfelelő helyettesítőjének tekinthető, ha kimutatták, hogy korrelálnak, mégis kevés tanulmány bizonyította ezt, és az eddig közölt eredmények nem meggyőzőek. Ezért a korlátozott ciklusú beágyazott QRT-PCR vizsgálatot alkalmazták a máj HCV-terhelésének mérésére. Az elemzéshez használt májszövet mennyisége 0, 8 és 8, 1 mg között volt (átlag = 3.88 6,1 mg), amelyből 2,1-12,9 (átlag = 6,62 3,1 6G) RNS-t extraháltunk. Az összes RNS hozama átlagosan 1,71 kb 103 Ft/G májszövet volt, hasonló érték, mint egy korábbi vizsgálatban 1,01 Ft 103 Ft RNS/g (13). Máj vírusterhelés mozgott 3.0 × 102 1,3 × 106 HCV-RNS molekulák/µg teljes RNS, valamint az átlagos volt 2.38 × 105 ± 3.55 × 105 kópia/µg az RNS. Korrelációt mutattak ki a máj vírusterhelése között, amelyet az összes RNS MIKROGRAMMONKÉNTI HCV kópiáinak száma és az Amplicor Monitor assay-vel mért szérum vírusterhelés között mértek, bár gyenge volt (r = 0, 417, n = 20) (13). Más vizsgálatok kimutatták, hogy a szérum HCV RNS terhelését lényegében tükrözi a vírus mennyisége a májban, anélkül, hogy korrelációs együtthatókat (3, 8) biztosítanánk. Itt először számolunk be statisztikailag szignifikáns korrelációról a máj és a szérum vírusterhelés mérése között (r = 0,689, P = 0.004, n = 15), jelezve, hogy a viremia szintje valójában tükrözi a májban jelen lévő vírus mennyiségét (ábra. (Ábra.22).

a korábbi vizsgálatokban a máj vírusterhelésének méréseit a májszövet milligramm példányszámában vagy a teljes RNS mikrogrammonkénti példányszámában fejezték ki. Ebben a tanulmányban megmutatjuk, hogy bármelyik egység megfelelőnek tűnik, mivel szignifikáns korreláció volt a májszövet milligramm kópiaszámában mért vírusterhelések és a teljes RNS mikrogrammonkénti kópiaszámában mért értékek között (R = 0,937, P < 0,0001, n = 20) (ábra. (Ábra.3).3). Ezek az eredmények összhangban vannak De Moliner et al. (3), aki szintén szoros összefüggést mutatott a máj vírusterhelése között, a szövet grammonkénti kópiaszám és a teljes sejtes RNS mikrogrammonkénti kópiaszáma között (r = 0,85) (3). Az átlagos száma HCV-RNS molekulák grammonként a májszövet 2,1 × 108 ± 3.71 × 108, mintegy 170-szer magasabb volt, mint az RNS szint szérum (1.22 × 106 ± 2.0 × 106 kópia/ml). Ez a megállapítás hasonló a Terrault et al. (18), aki kimutatta, hogy a HCV RNS aránya a májban a szérumban 103:1 volt. Ellentétben, McGuiness et al. (13) megállapította, hogy a májszövet szintje >104 tényezővel nagyobb volt. Ez a különbség vonatkozhat az a tény, hogy a máj vírusos rengeteg a betegek az előző tanulmány, aki elsősorban a fejlett HCV fertőzés, ott voltak eightfold magasabb (1.83 × 106 ± 0.75 × 106 kópia/µg az RNS), mint azok rögzítik, hogy a jelen tanulmány (2.38 × 105 ± 3.55 × 105 kópia/µg az RNS).

összefoglalva, a valós idejű QRT-PCR vizsgálat érzékeny, pontos és megbízható módszer a HCV terhelés monitorozására mind a szérum, mind a máj mintákban.