ADP-ribosilazione
Per lungo tempo, la funzione del coenzima NAD è stata ritenuta correlata al suo ruolo nelle reazioni redox. Tuttavia, negli ultimi 20 anni, prove sperimentali hanno suggerito che NAD partecipa agli eventi di ribosilazione ADP.
Nel NAD, la scissione del legame glicosidico tra il C1′ del ribosio e l’N11 della nicotinamide rilascia nicotinamide e ADP-ribosil (Fig. 24.1). Questo può essere collegato a una varietà di molecole di accettore. Sono note numerose reazioni NAD-dipendenti per il trasferimento di ADP-ribosio (ADP-ribosilazione); tutte sono di grande importanza funzionale.
Figura 24.1. ADP-ribosio.
Mono-ADP-ribosilazione. In questa modifica posttranslational, il ribosyl di ADP da NAD è trasferito ad un residuo di amminoacyl (arginina, cisteina, asparagina, o istidina) di una proteina del accettore. Va notato che il legame della nicotinamide ADP-ribosil in NAD è un legame ad alta energia; la sua rottura fornisce l’energia che rende possibile la reazione. La mono-adenosinedifosfato-ribosil transferasi (ART), inizialmente descritta nelle tossine batteriche e successivamente nelle cellule eucariotiche, catalizza la reazione.
La tossina del colera promuove il trasferimento di mono-ADP-ribosil alla subunità α della proteina Gs e la attiva. Ciò porta alla stimolazione dell’adenilato ciclasi, aumento dei livelli di AMP ciclico e maggiore funzione dei canali di trasporto degli ioni nella membrana luminale degli enterociti. Ciò causa una grave diarrea, un sintomo caratteristico dell’infezione da tossina del colera. La tossina della pertosse (prodotta dai batteri che causano la pertosse) determina l’ADP-ribosilazione dei residui cisteinilici e disaccoppia la proteina G dal suo recettore. La tossina difterica e l’esotossina pseudomonas fermano la sintesi proteica mediante ADP-ribosilazione del fattore di allungamento 2 (EF2). Clostridium tossina ADP-ribosilati molecole di actina e impedisce la sua polimerizzazione. Queste azioni mostrano che la mono-ADP-ribosilazione influenza marcatamente la funzione della proteina modificata.
Nell’uomo sono stati riconosciuti diversi enzimi di ribosilazione ADP. Alcuni sono ancorati dal glicosil-fosfatidilinositolo alla superficie esterna della membrana plasmatica (ectoenzimi) e altri sono all’interno della cellula (endoenzimi).
La scoperta di ectoenzimi che agiscono su NAD situati all’interno delle cellule è stata sorprendente. Si ritiene che questi enzimi utilizzino il NAD rilasciato nello spazio interstiziale da cellule lisate; in alternativa, è stata proposta l’esistenza di canali che consentono l’uscita del NAD attraverso la membrana plasmatica. Gli ectoenzimi sono funzionalmente associati alla modulazione della differenziazione dei miociti e ad altri processi associati a risposte immunitarie e infiammatorie, come la chemiotassi, il reclutamento di neutrofili, l’inibizione della citotossicità delle cellule T e l’adesione cellulare.
Le ARTI intracellulari sono coinvolte nella regolazione dei sistemi di trasduzione del segnale in cui le proteine G sono coinvolte e fungono da substrati ART. La mono-ADP-ribosilazione può influenzare la segnalazione e promuovere vari effetti cellulari. L’inibizione della traduzione proteica, la regolazione dell’apparato di Golgi e la funzione del citoscheletro sono il risultato di queste modifiche post-traduttive.
Poli-ADP-ribosilazione. Questo è un altro tipo di modifica posttranslazionale catalizzata da poli-adenosinedifosfato-ribosil polimerasi (PARP). Diciotto geni PARP sono stati identificati, ma non tutti gli enzimi codificati da questi geni sono stati caratterizzati. PARP lega inizialmente ADP-ribosil ai residui di glutamile o aspartile nella proteina accettore. Quindi, continua a inserire molecole di ADP-ribosile, attaccandole linearmente mediante legami glicosidici 1′
2′. Ad ogni 40-50 unità, i punti di diramazione vengono creati nella catena principale, inserendo 1 ‘ 3 ‘ legami. PARP può anche subire auto-poly-ADP-ribosilazione; uno dei principali substrati di PARP è PARP stesso.
I polimeri ADP-ribosio sono altamente elettronegativi e influenzano le proprietà della proteina modificata. L’aumento della carica negativa della proteina aumenta la repulsione della proteina ADP-ribosilata con altri polianioni, come il DNA; o attira molecole caricate positivamente, come gli istoni.
Tra le polimerasi ADP-ribosil conosciute, alcune si trovano nel nucleo. PARP-1 e PARP-2 sono attivati dalla presenza di siti scissi nei filamenti di DNA, a cui PARP si lega. Questi siti scissi di solito si verificano durante la replicazione e la riparazione del DNA, o possono essere causati da agenti esterni. PARP-3, è spesso associato al centrosoma e PARP-4 è associato a particelle di ribonucleoproteina. PARP-7 e PARP-10 sono coinvolti nella ribosilazione dell’istone. TNKS e TNKS-2 sono anche poli-ADP-ribosil polimerasi e sono associati ai telomeri.
La modifica mediante poli-ADP-ribosilazione delle proteine basiche, come gli istoni, altera le interazioni DNA-istone e le attrazioni intra – e internucleosome, promuovendo una struttura cromatina più flessibile. Questo facilita l’accesso al DNA degli enzimi coinvolti nei processi di replicazione e riparazione, tra cui elicasi, topoisomerasi, polimerasi e ligasi. Il PARP-ADP-auto-poliribosilato tende a respingere i filamenti di DNA vicini mentre la sua carica elettronegativa aumenta e infine si separa.
Il PARP associato ai telomeri promuove l’attività della telomerasi nell’allungamento dei cromosomi. Inoltre, la loro presenza serve a respingere altri filamenti di DNA e prevenire anomalie, come traslocazioni e fusioni di ricombinazione end-to-end o deleterie.
La poli-ADP-ribosilazione di alcuni enzimi può modificare la loro attività; ad esempio, può stimolare la DNA ligasi e inibire l’endonucleasi, prevenendo la degradazione del DNA.
PARP è coinvolto nella regolazione della struttura della cromatina, trascrizione, replicazione, riparazione, mantenimento dell’integrità del DNA e stimolazione della DNA ligasi. L’assenza o la diminuzione dell’attività PARP porta all’instabilità del genoma.
Il PARP associato ai centrosomi contribuisce ad una separazione ordinata dei cromosomi durante la mitosi.
PARP è anche coinvolto nella differenziazione cellulare e nella degradazione delle proteine durante la morte cellulare programmata (apoptosi, Capitolo 32). I meccanismi di azione non sono ancora chiaramente compresi. PARP media l’apoptosi attraverso segnali proinfiammatori. Controlla il rilascio del fattore di induzione dell’apoptosi (AIF) dai mitocondri. Studi recenti hanno anche dimostrato una relazione tra poli-ADP-ribosilazione e poliubiquitinazione nell’etichettatura delle proteine per la degradazione.
In caso di stress cellulare, l’iperattivazione del PARP può portare all’esaurimento di NAD e ATP, con conseguenze devastanti per la cellula che finiscono nella necrosi cellulare.
Studi su animali da laboratorio hanno dimostrato che le condizioni ischemiche, nel cervello e nel cuore, sotto shock settico o gravi processi infiammatori migliorano quando PARP è inibito. È probabile che queste osservazioni avranno applicazione clinica; tuttavia, la sfida della ridotta attività della polimerasi ADP-ribosio che porta alla destabilizzazione del genoma, all’accumulo di mutazioni e, infine, alla trasformazione maligna (carcinogenesi), deve essere prima risolta.
I polimeri ADP-ribosio sono degradati dalla poli-ADP-ribosio glicoidrolasi, che rilascia ADP-ribosio libero. Un ADP-ribosio liasi rilascia la prima unità attaccata alla proteina. La pirofosfatasi separa l’AMP e il ribosio fosfato.
Deacetilazione NAD-dipendente. Esiste una famiglia proteica di deacetilasi NAD-dipendenti chiamate sirtuine, che rilasciano il gruppo nicotinamide da NAD e utilizzano acetato separato dalle proteine come accettore ADP-ribosil per formare 2′-O-acetil-ADP-ribosio. Questa attività è stata osservata per la prima volta nel lievito ed è stata designata con l’acronimo SIR (silent information regulator); in seguito è stata dimostrata anche nel nematode Caenorhabditis elegans e nella Drosophila melanogaster. La loro azione aumenta la durata della vita di questi organismi, in particolare in condizioni in cui i nutrienti nel mezzo sono limitati.
Le sirtuine (SIRT) comprendono una famiglia di sette membri proteici (da SIRT-1 a SIRT-7), che possono essere considerate una variante delle ADP-ribosilasi. Usano diversi substrati, come gli istoni, la proteina p53, i fattori di trascrizione, il fattore nucleare kB e altri. Ad esempio, la deacetilazione dell’istone induce una struttura più compatta della cromatina, che promuove il silenziamento genico e protegge le aree critiche dei cromosomi, come telomeri e centrosomi. La deacetilazione della proteina p53 è importante per la stabilità genomica; controlla il ciclo cellulare, la riparazione del DNA e l’apoptosi. La deacetilazione di p53 apparentemente aumenta la sua stabilità bloccando l’ubiquitinazione.
SIRT 1 è coinvolto nel metabolismo energetico, nella risposta allo stress ossidativo, nella senescenza cellulare e nella protezione dell’endotelia vascolare e dei nervi in diverse condizioni patologiche.
La nicotinamide rilasciata dalle deacetilazioni NAD-dipendenti agisce come un potente inibitore dell’attività della sirtuina, contribuendo alla sua regolazione.
Poiché l’azione delle sirtuine contribuisce al prolungamento della vita in alcuni organismi, si è pensato che fosse un fattore generale di prolongevity. Tuttavia, non ci sono ancora prove sufficienti per estrapolare questi risultati agli animali superiori.
Si ritiene che il mantenimento di livelli normali di poli-PARP polimerasi e sirtuine nelle cellule può prevenire o ritardare la carcinogenesi e disturbi legati all’invecchiamento.
Il prodotto 2 ‘ -O-acetil-ADP-ribosio, derivante dall’attività della sirtuina, funziona come secondo messaggero.
Le reazioni che non sono correlate alla modificazione posttranslazionale delle proteine, ma possono essere considerate varianti della ribosilazione ADP, generano composti con un’importante azione fisiologica: ADP-ribosio ciclico e acido nicotinico-ADP-ribosio-fosfato (NAADP) (vedere pag. 669).