発生生物学、幹細胞生物学、医 成体幹細胞のクローニングは、これらの細胞を未熟な状態に維持することが困難であることによって制限されています。 近年、技術革新は、組織のニッチ環境を模倣するための小分子および成長因子の使用および”オルガノイド培養”の促進など、幹細胞生物学の急速かつ劇的な進歩をもたらしている。
1975年、RheinwaldとGreenは、ヒトケラチノサイトを用いたヒト成体幹細胞培養の最初の成功例を確立しました。 具体的には、彼らは致命的に照射されたマウス線維芽細胞株、3T3-J2と組み合わせて、ヒトケラチノサイトを長期的に維持した。 Greenたちは、3T3細胞上で増殖したクローニングされたケラチノサイトに「幹細胞」という用語を使用しなかったが、継代後に分裂して新しいコロニーを形成する顕著な能力を持つコロニーを発見し、これを「ホロクローン」と呼んだ。 これらのホロクローンは、すべての層状上皮細胞におけるp63、幹のマスターレギュレータと強烈な核染色を示した小さな、未熟な細胞から成っています。 皮膚、肺気管支、乳腺、および膀胱尿路上皮を含む層状上皮では、幹細胞集団は主に基底層に局在し、未熟細胞はin vitro研究と一致するp63で染色された。 有意に、自己皮膚から単離され、拡張されたヒトケラチノサイトが正常に患者を燃やすために移植され、分割厚さの皮膚移植からその結果に似た永久 特に、移植のためにヒト角膜上皮細胞を単離および拡張するために、同じ手順が適用されている。 この技術は当時、表皮や角膜の幹細胞に限られていましたが、Greenたちは、基礎生物学や再生医療の分野でヒト成体幹細胞をクローニングするための基礎を作りました。
このレビュー記事では、上皮細胞技術の技術的ブレークスルーにつながった細胞培養システムの最近の研究の進捗状況と蓄積証拠の概要を提供します。 層状上皮細胞と柱状上皮細胞の両方のための新しい培養戦略は、ヒト上皮の開発が再資本化されることを可能にし、in vitroでヒト疾患モデルを生成す また、再生医療のための正常上皮細胞培養技術の可能性と可能なアプリケーションを議論し、個々の患者の表現型を再現する癌細胞培養システムを強調
層状上皮細胞培養
腺上皮および偽層上皮を含む層状上皮組織において、基底膜に局在するp63+細胞は、幹/前駆集団を維持し、機能組織を形成す 上述したように、皮膚ケラチノサイトおよび角膜上皮細胞などの上皮幹細胞のクローニングおよび拡張は、照射されたマウス3T3-J2線維芽細胞との共培養系において十分に確立されている。 しかし、この標準プロトコルは、主にケラチノサイトと角膜細胞の長期培養に限定されています。 それにもかかわらず、3T3フィーダー系で培養されたヒト細胞を含む多様な種からの胸腺上皮幹細胞の単離が報告されているように、胸腺上皮からのクローン化された幹細胞が報告されている。 さらに、Freyたちは最近、3T3フィーダー法を適用して、音波ハリネズミを発現し、膀胱尿路上皮の基底層に存在する尿路上皮幹細胞を単離した。 単離されたヒトおよびブタ組織からのこれらの尿路上皮幹細胞は、安定して3T3フィーダー層上に成長し、ヌードマウスにおける腎カプセル移植後、p63+基底細胞およびUroplakin2+および3+urothelial細胞を含む複数の細胞系統を生じることができた。 2011年、Pooja et al. 3T3培養システムを利用して、三つのタイプのヒト気道上皮幹細胞を単離する。 これらの気道上皮幹細胞は、in vitro分化後に異なる細胞表現型を示したが、未熟な幹細胞クローンは形態学的に区別がつかないように見えた（図10）。 1) . フォローアップ研究では、マウス気管および遠位気道上皮幹細胞の移植は、遠位気道幹細胞が容易にH1N1インフルエンザ損傷肺組織に組み込まれ、 移植された気管幹細胞は主要な気道にのみ局在していたのに対し、細気管支および肺胞は、移植された気管幹細胞は主要な気道にのみ局在してい クローン性幹細胞はまた、ヒト食道内視鏡生検サンプルから単離され、これらの細胞は、空気液界面（ALI）培養系におけるよく分化した、層状扁平上皮様構造を形成することができた。
3T3マウスフィーダー層上のヒト層状および柱状上皮幹細胞の細胞培養プロセスの概略図。 層状化された上皮幹細胞の場合、それらは生検から単離されるか、または外科標本は長期培養のために3T3層上にめっきされる。 柱状上皮幹細胞の場合、それらは幹細胞の成長および維持に不可欠である定義された因子を有する3T3層上にめっきされる。 上皮性幹細胞の形態学的に未熟なコロニー（小さな細胞を詰めたコロニー）を機械的にピックアップし、さらに均質な拡張を行う。 ALI培養では、細胞はトランスウェルで成熟した細胞型に分化する
Schlegelたちは、Rho関連プロテインキナーゼ(ROCK)阻害剤と3T3フィーダー細胞との組み合わせにより、ヒトケラチノサイト、前立腺細胞、乳腺細胞などの上皮幹細胞の増殖能が有意に増加し、この現象を”条件付きリプログラミング”と呼んだことを報告した。 患者から上皮幹細胞培養物を効率的に生成する能力は、細胞ベースの診断および治療法に関する重要かつ貴重な洞察を提供する。 さらに最近、Rajagopalたちは、Tgf Β/BMP/SMADシグナル伝達経路が、外胚葉由来の皮膚および乳腺組織、内胚葉由来の食道および前立腺組織、および中胚葉由来の精巣上体を含む様々な上皮組織において重要であることを明らかにした。 彼らは、SMADシグナル伝達の二重阻害（BMPシグナルはDMH-1によってブロックされ、Tgf ΒシグナルはA-83-01によって阻害された）が、ヒトおよびマウス上皮基底細胞集団の安定した増殖を容易にすることを発見した。 驚くべきことに、デュアルTgf Β/BMP阻害は、マウス3T3フィーダー細胞を必要とせずに上皮幹細胞の堅牢な拡張を可能にしました。
まとめると、これらの技術的進歩は、低分子およびフィーダー細胞と組み合わせて、in vitroで層状上皮幹/前駆細胞集団を継続的かつ効率的に拡大するため 層状上皮培養における別の画期的な、オルガノイド培養は、基底および管腔ヒト前立腺前駆細胞の両方を拡張するために利用されている。 これらのヒト管腔前駆細胞は多能性であり，ｉｎｖｉｔｒｏで前立腺様構造を形成した。 しかし、多くの研究者がスフェロイドおよびオルガノイド培養を報告しているが、真のin vivoアーキテクチャを再現するために層状または偽層状上皮からなる三次元構造を生成することは、挑戦的なままである。 この問題は、多能性幹細胞由来組織において実施されるように、自己組織化を容易にする方法を確立することによって解決することができる。
柱状上皮細胞培養
腸幹細胞は、腸上皮を維持するために高い回転率で増殖する顕著な能力を有し、肝細胞は損傷に応答して高度に再生されるが、柱状上皮細胞から幹細胞集団をクローン化する能力は、in vitroでの組織ニッチシグナルの欠如のために厳しく制限されている。 この10年間、Cleversたちは、腸幹細胞マーカーであるlgr5(ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体5)を、洗練されたマウスモデル(Lgr5-EGFP-ires-Creert2マウスとCre活性化Rosa26laczレポーターを交配)で発見し、複数の腸細胞型を持つ絨毛様構造と陰窩様のゾーンからなるマウス腸オルガノイド培養法を確立した。 成長因子および小分子カクテルと組み合わせて、単離されたLGR5+幹細胞画分をMatrigelに懸濁し、長期的に培養した。 ニコチンアミド、p38およびTgf Β受容体阻害剤を使用して培養条件を変更すると、小腸および結腸から単離されたヒト上皮細胞は、in vitroで無限に長期 この技術は、膵管細胞や肝細胞などの他のタイプの細胞の培養に適用可能であり、柱状上皮細胞培養の革命的な進歩を促進した。
オルガノイド培養は、Matrigelベースの3D培養プラットフォームを採用しており、成体上皮細胞を含む多様なタイプの成体上皮細胞を幹/前駆細胞集団と安定して培養するために広く使用することができる。 しかし、in vitroで均一な幹細胞の画分を迅速かつ効率的に増殖させる能力は、組織幹細胞における自己再生と運命の仕様の詳細な研究や再生医療のための細胞移植の可能性のある将来の応用のためにも有用で重要である。 今回、Xianたちは、小腸および結腸細胞を含むヒト胎児の腸幹細胞を均一に増殖させるための新しい培養系を開発した。 このシステムは、成長因子およびシグナル経路阻害剤と組み合わせて3T3マウスフィーダー層を用いて、ヒト柱状上皮幹細胞を頑健に増殖させた（図 1) . さらに、3T3線維芽細胞上で増殖した腸幹細胞の50％以上がコロニーを形成することができた。 哺乳類の腸では、wntやNotchシグナルなどの定義されたニッチ因子が、陰窩基部の腸幹細胞の幹性を支配するために不可欠である。 さらに、陰窩基部にも位置するパネス細胞は、幹細胞から生じ、パラクリン的に必須因子を提供することによって幹細胞ニッチとして作用する。 オルガノイド培養物は幹細胞とパネス細胞などの様々な誘導体からなるため、ニッチ因子は自律的に供給される。 対照的に、腸幹細胞の純粋な集団は3T3フィーダー層上で増殖されるため、細胞はニッチ因子を分泌することができない。 したがって、ニッチ因子に似た外因性因子を補充する必要がある。 幹細胞維持プロトコルに加えて、ALI培養モデルにおいて、少なくとも四つのタイプの主要な腸細胞、すなわち、パネス細胞、腸内分泌細胞、杯細胞、および腸細胞（腸吸収細胞）を生じるための分化プロトコルが確立されている。 腸絨毛様構造の形成は、小腸および結腸組織のような元の組織タイプに従って観察された（図10）。 1). 今回、Kuoたちは、別のALI培養アプローチで、間質要素を持つマウス新生児腸の小片を長期的に頑健に培養した。
内視鏡生検から得られたヒト胃幹細胞のクローン化にも同様の戦略が適用された。 具体的には、clonogenic胃の細胞は安定して成長因子と小分子との組み合わせで3T3フィーダー層に展開し、典型的には、ペプシノーゲン発現チーフ細胞などの胃に見 クローン化された消化器官幹細胞に加えて、遠位子宮管から卵管前駆細胞もニッチ因子の存在下で3T3フィーダー層上に無限に伝播することができた。 遠位卵管、線毛上皮は、以下の二つのタイプの細胞からなる単純な柱状上皮層である: 配偶子の輸送を促進する繊毛細胞、および粘液を分泌する分泌細胞。 腸幹細胞の分化プロトコルのわずかな変更を使用して、長期的なアリ培養卵管幹細胞は、in vivo上皮構造を連想させた繊毛細胞と分泌細胞の両方を含 幹細胞集団から適切な細胞型を有する上皮系統を産生する能力は、生理学的上皮発達および恒常性を研究し、in vitroで急性および慢性疾患モデルを開
がん細胞培養
1951年に子宮頸がん患者から最初のがん細胞株であるHeLa細胞株が確立されて以来、多種多様ながん型から確立されたがん細胞株は、がんの病態生物学を研究するために広く使用されており、in vivo異種移植モデルを生成し、in vitroおよびin vivoで抗がん薬を試験する機会を提供している。 がん細胞株を用いたがん生物学は大きく進歩していますが、これらの細胞を用いて得られた結果は、最近の次世代シーケンシングの進歩によって明らかにされたように、がんが患者間および腫瘍内の異質性を示すため、当初予想されていた疾患の複雑さを十分に反映していない可能性があります。 今回、Welmたちは、患者の遺伝子変異の状態や病態を含むがん表現型をより正確に反映するために、非肥満糖尿病性重症複合免疫不全(NOD-SCID)マウスを用いて、乳がんの患者由来異種移植(PDX)モデルを開発した。このモデルは、元の腫瘍の本質的な特徴を維持し、特定の部位への転移能を示した。 乳癌モデルに加えて、様々なタイプの固形腫瘍の確立は、新しい癌治療の前臨床試験を加速し、”個別化医療”の目標の実現に役立つことが期待されるPDXモデ
オルガノイド系やフィーダー系などの成体幹細胞の培養方法は、患者由来の癌細胞を使用するさまざまなアプローチにも適用可能です。 具体的には、Cleversらは、オルガノイド培養を用いて膵臓、前立腺、結腸直腸癌をモデル化できることを報告し、遺伝的異質性や薬物感受性を含む元の癌形質を再現することができることを示した。 したがって、彼らはこのシステムを”生きているオルガノイドバイオバンク”と呼んだ。 これらの技術は、ヒト食道腺癌の前駆体であるバレット食道などの前癌性病変から幹細胞集団を単離するためにも使用することができる。 単離され、拡張されたバレット食道幹細胞は、SV40大きなT抗原、hTERT、およびc-mycを導入することによって形質転換され、免疫不全NSG（NOD.Cg-Prkdcscid Il2Rgtm1Wjl/SzJ）マウスに異種 予想通り、バレット食道幹細胞はマウスで食道腺癌様腫瘍に形質転換した。 同様のアプローチは、ヒト卵管幹細胞が高悪性度漿液性卵巣上皮癌の起源の細胞であることを示した。 この発見は、最近のヒト病理およびトランスジェニックマウスモデルの証拠を裏付け、遠位卵管上皮がこの癌の起源の組織であることを示した。 CRISPR/Cas9システムと組み合わせて、正常な結腸幹細胞は、結腸直腸癌で頻繁に検出されるドライバー変異を導入することによって順次形質転換された。 得られた細胞は腎臓嚢内に異種移植片を形成させ，浸潤性および転移性を特徴とする腺癌様表現型への進行性形質転換を示した。 全体的に、腫瘍および患者にマッチした正常な上皮組織から細胞を単離および培養する能力は、癌生物学の分野における古典的なin vivo動物研究を補完するだけでなく、in vitroで患者特異的な遺伝学およびゲノミクスのアプローチを容易にするプラットフォームの生産を容易にする。
成体幹細胞を用いた炎症疾患のモデル化
ヒト疾患のモデル化は、ヒト疾患組織の限られたアクセス可能性によって妨げられている。 それにもかかわらず、成体幹細胞培養の進歩は、幹細胞を拡大し、小さなヒト生検サンプルから成熟細胞型を導出することにより、in vitroで疾患表現型を再現することを可能にした。 ALIやオルガノイド培養などの3D培養法は、複数の細胞型からなり、in vivoで観察される上皮構造に似た構造を提供するため、感染症や遺伝性疾患を含む炎症性疾患の研究に適しているはずである。 具体的には、病原体（または主な原因）および標的細胞型が知られている場合、疾患表現型を再現することは簡単である。
偽膜性大腸炎（PMC）は、抗生物質治療後のクロストリジウム-ディフィシル（C.difficile）の人口が不釣り合いに増加したことによって引き起こされる。 C.difficileはグラム陽性の胞子形成細菌であり、体液分泌、炎症、および結腸組織損傷を誘発する高分子量毒素TcdAおよびTcdBを産生する。 ＡＬＩ培養中のクローン性結腸幹細胞から分化した結腸上皮細胞は，時間および用量依存的に壊滅的な上皮損傷を引き起こしたこれらの毒素で挑戦された。 この結果は、3D培養モデルは、C.difficile病理を表すために使用することができることを示した。 同様に，慢性胃炎，胃潰ようおよび癌を引き起こすＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ（ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）感染の効果を，ｈ．ｐｙｌｏｒｉをオルガノイド培養にマイクロインジェクションすることにより研究した。 細菌感染オルガノイド培養は、NF-κ b活性化およびIL8誘導などの炎症の増加を示し、IL8発現は、ピット型オルガノイド培養よりも腺型オルガノイド培養
成体幹細胞はまた、遺伝性疾患をモデル化するために使用されている。 Beekmanたちは、嚢胞性線維症（CF）患者に由来する腸内オルガノイド培養を報告した。 CFは、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレータ（CFTR）の変異によって引き起こされ、これは通常、肺および消化組織のような多くの器官の上皮細胞 正常な腸オルガノイド培養ではフォルスコリンに応答して強い腫脹を示したが，ｃｆオルガノイド培養では腫脹応答は観察されなかった。 さらに、CF患者の腸オルガノイドにおいてCRISPR/Cas9技術を用いて変異CFTR遺伝子座を補正した場合、補正された遺伝子は機能的に機能することが示された。 したがって、遺伝子編集技術と組み合わせて、複数の細胞型を持つin vivo表現型に似た成体幹細胞のin vitro分化は、ヒトの疾患を治療するための強力な手段を提供し、ヒトの病理学への直接の洞察を提供する可能性があります。
再生医療への上皮性幹細胞の応用
再生医療への応用にはヒト胚性幹（ES）細胞と人工多能性幹（iPS）細胞を用いる有望な戦略があるが、これらの戦略の臨床試験はほとんど行われておらず、系統指定の困難さと腫瘍形成の可能性がある。 成体幹細胞は本質的に特定の組織型にコミットされているため、意図された細胞型を産生することは比較的容易であり、腫瘍形成の潜在的リスクは したがって、治療アプローチは、移植のための細胞源として成体幹細胞を使用することを目指している。 グリーンらは1975年にヒトケラチノサイト培養法を確立し、培養細胞は火傷や化学傷害の患者に移植可能であったが、他のタイプの成体幹細胞の長期培養には重大な技術的障壁があった。 上記のように、最近の技術的進歩は、多様なタイプの上皮細胞に対するこの制限を克服した。 したがって、幹細胞集団を迅速かつ効率的に拡大する能力は、再生医療におけるそれらの使用にとって貴重である。
例えば、マウスLgr5+結腸幹細胞をオルガノイド培養で増殖させ、損傷したマウス結腸に移植し、25週間後にも自己再生-分化できる生着細胞を検出した。 Zhang Kたちは、別のアプローチで、人工成体幹細胞を移植研究のために利用した。 まず、フィーダー細胞のない皿の中で角膜上皮細胞を培養することに成功し、pax6が皮膚ケラチノサイトから角膜幹細胞（CSCs）を分化させる重要な転写因子であることを発見した。 驚くべきことに、ケラチノサイトにおけるPax6過剰発現は、辺縁系幹細胞様細胞を誘導し、これらの細胞は、ウサギの損傷した角膜に移植することがで ケラチノサイトはＣｓｃよりも容易にアクセス可能であるため，この方法はヒト眼疾患の治療に適用できる可能性がある。 より最近では、Ｌｉｕ ｅ ｔ ａ ｌ． 内因性幹細胞を使用した組織修復および再生のための魅力的なアプローチを報告した。 彼らの研究では、Pax6とBmi1を発現した水晶体上皮幹細胞（LECs）を特徴付け、in vivoで再生可能性を示した。 内因性ｌｅｃｓを保存する外科的白内障除去法を用い，これらのＬｅｃｓはウサギ，マカクおよびヒト乳児における視覚機能を有するレンズの自発的再生に寄与した。 この方法は白内障治療のための治療上の画期的なものであり、人工眼内レンズ移植に代わる可能性がある。
多くの上皮細胞の回転率が高いため、幹細胞集団の移植は長期的な組織維持のために不可欠である。 理論的には、単一の幹細胞は、組織全体を再構成することができ、いくつかの研究グループは、経験的にこの概念を実証しました。 多能性幹細胞（Psc）はすべての細胞型を生じさせる可能性があるにもかかわらず、PSC由来の組織幹細胞は、in vitroで未熟な状態に維持することができな したがって、再生医療のための成体幹細胞の使用は重要な利点を提示します。