精管切除後の期間と精巣上体吸引によって得られた精子の生殖能力との関係

要約

背景:精管切除後の経過時間が精巣上体精子を用いたIVF–ICSIの結果に影響を与えるかどうかは明確に定義されていない。 我々は遡及的に精管切除男性の精子は精管切除後の異なる期間で使用された151ICSIサイクルの結果を分析しました。 方法：組換えＦＳＨおよびＨＣＧに関連してＧｎｒｈアゴニストを用いた脱感作卵巣刺激プロトコルの後に卵母細胞を得た。 経皮的精巣上体精子吸引により精子を回収した。 サイクルは、精管切除後≥10年（グループ1、n=47）、精管切除後11-19年（グループ2、n=79）、および精管切除後≥20年（グループ3、n=25）の三つのグループに分割された。 結果: 予想されるように、男性の平均年齢は三つのグループで異なっていた（グループ3>グループ2>グループ1）、女性の平均年齢もグループ3で1と2よりも有意に高かったが、グループ2と3の間に差は記載されていなかった。 他のすべての実験室および臨床パラメータは、三つのグループで類似していた。 進行中の妊娠および着床率（それぞれ34、25、8％および22、15、6％）は、グループ1からグループ3に有意に減少した。 結論: 精管切除男性からの精子を用いたＩＣＳＩ後の妊娠および着床率は，精管切除からの時間間隔と負の相関を示したが，これは男性または女性の老化によって純粋に説明することはできなかった。

はじめに

ICSIは、男性因子不妊症を緩和するために最初に開発された成功した生殖補助治療技術である(Palermo et al. 1992年;Van Steirteghem et al., 1993). 射精された精子で達成された結果は、精子の濃度または形態に関連していないようである（Nagy et al. ら、１ ９ ９ ５ａ；Ｓｖａｌａｎｄｅｒ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1996). 予後は、運動性精子が見つからない場合にのみ損なわれる（Nagy et al.、1995a）。

精巣上体および精巣精子吸引は、閉塞性および非閉塞性無精子症の場合に精子を得るために日常的に使用される。 受精率は、これらの場合において、射精からの精子で得られたものと同様である（Nagy et al. ら、１ ９ ９ ５ｂ；Ｖａｎ Ｓｔｅｉｒｔｅｇｈｅｍ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1998). 従ってICSIはreanastomosisが失敗したか、または精管切除からの時間スパンが副睾丸の妨害の二次場所で起因したポストの精管切除の場合の豊饒を元通りにす さらに、ＩＣＳＩは、これらの男性に頻繁に存在する抗精子抗体の繁殖力に対する負の影響を排除し得る（Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1994). 精管切除後の男性を含むほとんどの閉塞性症例では、精巣上体の精子吸引は、精子を得るための選択方法である（Craft et al., 1995). 微細針吸引は、技術として、精巣上体または精巣上体に対する顕微外科的介入よりも簡単で侵襲性の低い手順である（Ｔｕｒｎａｙｅ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1998).

最近の報告では、男性の生殖能力は年齢とともに低下することが示唆されている(Auroux,1993)。 しかし、正常な健康な男性では、精液の品質自体は時間とともに有意に低下しないことが以前に発表されている（Fisch et al., 1996). さらに、ＩＣＳＩ転帰は、父方の年齢に関連していないようである（Ｓｐａｎｄｏｒｆｅｒ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1998).

一方、精管切除後の男性には、精液の質および生殖能力に対する時間関連の負の影響が記載されている(Urry et al., 1990). 抗精子抗体および精子凝集の発生率が高く、運動性精子の割合が減少することが報告されている（Weiske、2001）。

再吻合に対するICSIの上記の利点のために、ICSIによる治療を求めている閉塞性無精子患者のかなりの割合は精管切除された男性である。 精管切除後の期間がＩＣＳＩ-ＩＶＦの転帰に影響を及ぼすかどうかは現時点では分かっていないので，精管切除後の期間とｉｃｓｉ後の精子生殖能力との関係を解析した。

材料と方法

精管切除後の閉塞性無精子症のために行われた151ICSIサイクルの結果を遡及的に分析し、1998年から2000年にかけて完了しました。 患者は精管切除後の期間に応じて三つのグループに割り当てられた。 精管切除からの間隔は、精管切除の日付からICSIの時間までの最も近い完了年に四捨五入された。 すべての症例は，ｖａｓの再吻合よりもＩＣＳＩを主要な治療形態として選択したため，当センターに紹介された。 全例に経皮的精巣上体精子吸引術（ＰＥＳＡ）を施行した。 グループ1は精管切除からの期間が≥10年だった47サイクルで構成されていました; グループ2は精管切除からの期間が11と19年の間であった79サイクルを含み、グループ3は精管切除からの期間が≥20年の25サイクルを含んでいた。＜７ １ ３ ３＞＜７ ７ ９ ７＞卵巣刺激は、Ｇｎｒｈアゴニスト（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ ａｃｅｔａｔｅ，Ｌｕｐｒｏｎ（登録商標）；Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｏｓ ｄ ｏ Ｂｒａｓｉｌ Ｌｔｄａ，Ｓａｎｏ Ｐａｕｌｏ，Ｂｒａｇａｌ）、ｌｏｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌおよび組換えＦＳ Ｈ（Ｇｏｎａｌ−Ｆ（登録商標）；Ｓｅｒｏｎｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｏｓ，Ｓａｎｏ Ｐａｕｌｏ，Ｂｒａｇａｌ）の組み合わせを用いて行った。 ろ胞の開発は血清のestradiolおよび腟の超音波の周期的な測定と監視されました。 HCG10 000IU(Profasi®; 少なくとも二つの卵胞が18ミリメートルの平均直径に達し、卵母細胞の検索は、超音波ガイド経膣吸引34時間後に行われたときにSerono Laboratorios）を投与した。

精巣上体の精子吸引

精子はPESAによって回収された。 27.5ゲージの針を精巣上体の近位部分（通常は睾丸の上部極に位置する）に導入し、1mlの注射器（B-D;Becton Dickinson Ind. ブラジルのクリチバ州、Cirúrgicas Ltda）。 吸引液をペトリ皿の中に入れ、ＩＶＦ−５ ０培地（ＩＶＦ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｃａｎｎｉｚａｎ，Ｇｏｔｅｎｂｕｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ）でフラッシュした。 サンプルは、運動性精子の存在を評価した。 サンプル中に運動性精子が存在しなかった場合、精巣上体吸引を繰り返した。

発生学実験室の手順

純粋な濾胞液中に採取した卵母細胞を直ちに隣接する発生学実験室に送り、×50の倍率で解剖顕微鏡を用いて同定した。 同定された後、卵母細胞を単一の井戸培養皿に入れた（3260; ０ｍｌの８ ０ＩＵ／ｍｌのヒアルロニダーゼ（Ｈｙａｓｅ−１；ＩＶＦ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｃｕｎｄａｎｉａｎ）で３ ０秒間洗浄し、続いてＩＶＦ−５ ０培地中で数回洗浄した。 各卵母細胞を、３ ０μ ｌのＩＶＦ−５ ０培地の１つの液滴の中に別々に入れ、軽量の鉱油（Ｏｖｏｉｌ１ ５ ０；ＩＶＦ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｃｕｎｄａｎｉａｎ）で覆い、５％ＣＯ２を含む雰囲気中で３ ７℃で２〜４時間インキュベートした。 潜伏期の終わりに、細胞ストリッパーに接続された直径１ ３ ５μ ｍのプラスチック製ピペット（Ｍｉｄ Ａｔｌａｎｔｉｃ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．、メドフォード、ニュージャージー州、米国）。＜７ １ ３ ３＞＜７ ７ ９ ７＞核成熟度および卵質質を、反転光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（登録商標）；Ｎｉｋｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、×２ ０ ０または×４ ０ ０の倍率で評価した。 中期II（MII）卵母細胞は、収集後2-4時間の期間内にマイクロインジェクションされました。 中期I（MI）卵母細胞は、検索後8時間までの4時間間隔で最初の極性体の押出のために観察され、注入はそれに応じて行われた。 精子注入のための方法は、以前に報告されている（Abdelmassih et al., 1996).

精子注入後、卵母細胞を鉱油で覆われた1mlのIVF-50培地中で16〜18時間インキュベートした。ICSIの16〜18時間後、卵母細胞は前核および極性体の有無につ、1998a）。 二つの明確に異なる前核が存在する場合，受精は正常と考えられた。 単一の前核が観察された場合、第二の評価は約4時間後に行われた。 三つの前核の存在が検出されたとき、卵母細胞は廃棄された。

二つの前核を含む卵母細胞を、ペトリ皿（3260;Costar）中の鉱油で覆われたIVF-50培地30μ lの液滴中で別々に培養し、移動するまで保持した。 胚は、注射後４ ２時間（２日目）および６ ８時間（３日目）で観察され、Ｓｔａｅｓｓｅｎによって提案された基準に従って分類された（Ｓｔａｅｓｓｅｎ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1989). 割球の数と透明帯に存在する無核断片の相対的な割合に応じて、胚は四つのカテゴリーのいずれかに分類された: 1、優れた（タイプA）、無核断片が存在しなかったとき（6-8細胞ステージ3日目）;2、良い（タイプB）、胚の<20％が断片化されたとき（6-8細胞ステージ3日目または<6細胞断片化されている。 >50％の断片化を有する胚は移植されなかった。＜７ １ ３ ３＞＜７ ７ ９ ７＞移植時に、２ ３ｃｍのＥｄｗａｒｄｓ Ｗａｌｌａｃｅカテーテル（Ｓｉｍｃａｒｅ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｌｔｄ，Ｈｙｔｈｅ，Ｋｅｎｔ，ＵＫ）を使用して、１ ５μ ｌのｉｖｆ−５ ０培地に胚を装填した。

黄体期は、800mgの膣プロゲステロン（Utrogestan（登録商標）；Laboratoires Besins-Isvovesco、パリ、フランス）および経皮100μ gのエストラジオールパッチを毎日変更した（Estraderm TTS100（登録商標）；Biogalúnica Laboratório、サンパウロ、ブラジル）の毎日の投与によって支持された。 血清β-HCGレベルは、胚移植の12日後に測定した。

経膣超音波は、上昇β-HCG力価を有するすべての患者において行われた;子宮内妊娠嚢の存在および数、ならびに胎児極および心臓活動の存在を評価した。 妊娠は患者の産科医によって監視され、最終的な結果は産科医と患者の両方によって診療所に報告された。

統計分析

one way analysis of variance(ANOVA)およびKruskal–Wallis検定を使用して、女性と男性の年齢、受精率、胚の質、移植された胚の数、精管切除後の期間の平均を比較しました。 分割表分析とフィッシャーの正確なテストは、妊娠、着床および中絶率を比較するために使用されました。

結果

研究に含まれる151サイクルの最も重要な結果を表Iに示します。 男性の平均年齢はグループ1から3に増加し、各グループの差は統計的に有意であった（P<0.0001）。 平均女性年齢は、1群では2群および3群と比較して有意に低かったが、2群では3群と比較して差はなかった（表I）。

回収および注入された卵母細胞の平均数および受精率は、3つのグループすべてで類似していた。 胚の質および移植された胚の数もまた、３つの群において類似していた（表ｉ）。

臨床妊娠率および進行中の妊娠率は精管切除の期間と有意に相関し（P<0.05;傾向のσ2テスト）、精管切除の期間が長かったことは妊娠の減少と関連していた（表I）。 移植率もグループ1から3に減少し、すべてのグループ間の差は統計的に有意であった（p<0.05、分割表分析およびフィッシャーの正確な検定）。 中絶率は、グループ1から3に増加する傾向を示したが、それはグループ間で統計的有意性に達しませんでした。

結果に対する女性の年齢の影響を排除するために、84サイクルのうち151サイクルのデータを分析し、35歳以上の女性のみが含まれていました。 三つのグループの平均男性年齢の差は有意であった（P<0.0001）が、女性年齢は三つのグループ間で有意に差はなかった。 注入および受精した卵母細胞の数は、患者に移植されたはいの数および質と同様に、三つの群でも類似していた。 進行中の妊娠および着床率は、グループ1および2でグループ3と比較して有意に高かった（表II）。

ディスカッション

私たちのデータは、ICSIと組み合わせた経皮的精巣上体精子吸引が精管切除後不妊の緩和のための成功した治療選択肢であるこ 精液検索の技術は簡単、ローカルanaesthesiaと行われ、副睾丸への明らかな損傷なしで繰り返すことができます。

重要なことに、我々の研究の結果は、補助受精の妊娠転帰と精管切除から治療までの期間との間に負の相関が初めて示唆された。 妊娠率と着床率の差は，女性の年齢に対して結果を修正した後も持続した。 残っている唯一の明らかな臨床差は、グループ間の男性の平均年齢と精管切除の期間であった。 生殖補助の結果に対する男性の年齢の影響は十分に決定されていない。 いくつかの研究では、男性の年齢が進むにつれて生殖能力の低下が示唆されています（Auroux、1993）が、ほとんどの研究では老化と男性の生殖能力との間に相関 また、最大25年間の個々のフォローアップは、重要な変化を明らかにしなかった（Fisch et al., 1996). さらに重要なのは、我々の研究に関して、異なる診断カテゴリーのICSI結果は、男性パートナーの年齢によって影響されない（Spandorfer et al.,1998)女性パートナーの年齢の重要な役割とは対照的に(Abdelmassih et al., 1996; Devroey et al., 1996).

生殖能力の回復における精管切除逆転の成功率は、精管切除からの期間と逆の関係である(Belker et al., 1991). これまで、生殖能力に関連する精管切除の時間関連の負の効果は、解剖学的修復をより困難にした機械的要因（副睾丸閉塞の二次部位の発生率の増加）、およ, 1996). ICSIは明らかに機械的閉塞を克服し、この技術で得られた結果は免疫学的要因とは無関係である（Nagy et al.,1995c).

我々の研究に含まれるすべての症例は、精巣上体精子吸引を受けた。 Silber et al. 慢性的に閉塞した精巣上体の場合、精子は老化に関連する変化に苦しみ、遠位部分に向かって運動性が有意に低下することが示唆されている（Silber et al., 1995). 一方、ムーアは、これらの場合、不均衡な数の死滅または死にかけている精子が近位部分にも見られることを報告している（Moore、1998）。 著者は、正常な状態では、精巣上体液は、変性の過程で精子によって遊離された先体酵素から生存可能な精子を保護することを示唆している。 慢性閉塞に続発する停滞は、この防御機構を妨害するであろう。 さらに、閉塞性無精子症を有する男性において、精巣精子ＤＮＡは、近位精巣上体精子ＤＮＡよりも有意に損傷が少ないことが実証されている（Ｓｔｅｅｌｅ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1999). 同じ研究で、著者らは、睾丸から得られた精子のDNA品質が正常な男性に見られるものと同じであることを見出し、精巣上体精子に見られる損傷が産生後の時間とともに獲得されることを示唆している。 精巣上体の精子DNA損傷は、閉塞の時間とともに増加し、ここで提示された症例では精管切除からの時間が増加すると推測することは魅力的である。 同じ考え方では、ICSIのための射精または精巣上体精子（壊死性精子症による）の使用は、非常に貧弱な受精および胚発生と関連していた; しかしながら、精巣精子（同じ患者からの）は、たとえ運動不能であっても、治療サイクルのはるかに改善された結果を提供した（Nagy et al. ら、１ ９ ９ ５ａ；Ｔｏｕｒｎａｙｅ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ９ ６；Ｎａｇｙ ｅ ｔ ａ ｌ．,1998b)。

この研究では、受精率および受精後72時間で移植された胚の質に有意差は認められなかった。 受精に対する分子的に損傷した精子の使用の効果は、ICSIの使用でマスクすることができ、胚発生の初期段階は、胚ゲノムが8細胞段階の後に活性化され, 1988). しかし、精巣上体精子のDNA損傷の増加（報告された症例でのみ使用される）は、より低い胚移植率と精管切除からのより長い期間の症例で見られる中絶のより高い率のための説明を構成することができる。

我々の結果は、他の人が報告したデータとは異なる(Sukcharoen et al.,2000)しかし、直接的な矛盾ではないかもしれません. 本研究に含まれる症例数は有意に多く，以前に報告されたデータには，精巣から得られた精子でＩＣＳＩを行った症例が含まれていた。

ここで報告された知見は、重要な臨床的意味を有する可能性がある。 経皮的精巣上体精子吸引は、閉塞性無精子症の男性から精子を得るための、簡単で迅速かつ一般的な手順です; しかし，本研究に照らして，精巣からの細針吸引は，特に閉塞時間が長い場合には，より良いアプローチを表す可能性がある。 しかし、これらの症例における最良の介入を確立するためには、前向き研究から得られたデータのさらなる収集および分析を実施すべきである。