CDNAマイクロアレイ技術の概念的かつ実用的な概要:基礎および臨床科学への影響

Braz J Med Biol Res,October2005,Volume38(10)1543-1552(Review)

cDNAマイクロアレイ技術の概念的かつ実用的な概念的な概要:基礎および臨床科学への影響

V.de Mello-Coelhoおよびk.l. ヘス

Departamento de Histologia e Embriologia,Instituto de Ciúncias Biomédicas,Universidade Federal do Rio de Janeiro,Rio de Janeiro,RJ,Brasil

Abstract
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Correspondence and Footnotes

Abstract

cDNAマイクロアレイは、何千もの遺伝子の発現を同時に解析することを容易にする革新的な技術です。 急速に進化しているこの方法論の利用には、生物学、数学、統計科学の専門知識の組み合わせが必要です。 このレビューでは、cDNAマイクロアレイ技術の原理、得られたデータの分析処理の実用的な懸念、組織マイクロアレイにおける免疫組織化学などの他のデー

キーワード: バイオテクノロジー、cDNAマイクロアレイ、遺伝子発現、ゲノミクス

はじめに

遺伝子は、細胞核内の染色体に組織化されたデオキシリボ核酸（DNA）配列によって形成される遺伝的単位である。 これらの配列からの転写の複雑なプロセスは、メッセンジャーリボ核酸（mRNA）の生成をもたらす。 これらのmRNAは、アミノ酸から構成されるタンパク質をコードし、遺伝子の指定された機能を果たす（1）。 したがって、細胞および組織の構造的および機能的特徴は、何千もの遺伝子の同時、選択的、および差動発現によって決定される。

過去10年間、遺伝子マッピング、クローニング、および配列決定に関する研究は、異なるゲノムの構造解析のための重要な情報を提供してきた(2,3)。 これらの調査から得られる情報の量は、取得したデータの編成を必要とする。 このニーズを満たすために、何百万もの遺伝子配列と発現配列タグ（ESTs）を格納するための公開データベースが作成されており、異なる種のゲノム間の類似性と相違点の分析のための遺伝子配列へのアクセッションを可能にしている（4）。

ゲノムの構造研究は、様々な生物の異なる細胞型および組織における遺伝子発現プロファイルの機能的および調節的理解に関連する多くの疑問を提起している（3,5,6）。 DNAマイクロアレイ技術は、数千の遺伝子（7,8）を含む複雑な生物学的処理を研究するために開発されました。 そのようなマイクロアレイ技術の一つは、フォトリソグラフィー（9）を使用してガラス表面に刻印されている単一のDNA鎖またはプローブ（オリゴマー）を使用 本レビューの焦点である別のDNAマイクロアレイ方法論は、相補的なDNA（cDNA）マイクロアレイ技術（10）です。 これらの方法論により、1)細胞または組織における何千もの遺伝子の動的発現パターンを同時に比較すること、2)分化、増殖、アポトーシスの誘導などの細胞プロセスの異なる段階における分子差を検出すること、3)非罹患状態と病理学的状態の間の転写差を同定すること、4)薬物応答による細胞の変化を同定すること、および5)疾患の診断、予後および臨床治療における潜在的な使用のための新規バイオマーカーを同定することが可能である。

cDNAマイクロアレイ技術の原理

特定の細胞におけるmRNAの検出および定量に使用される古典的な方法論は、ノーザンブロット分析と呼ばれています(11)。 ノーザンブロット分析の主な原理は、その遺伝子が存在するかどうかを決定するために、フィルターに結合したmRNAへの放射性標識された遺伝子特異的プ 特定の遺伝子の発現を検出するために使用される別の方法は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）である。 RT-PCRは、mRNAへのcDNA配列を合成するための遺伝子特異的プライマーおよび逆転写酵素の使用を含む。 次いで、このｃＤＮＡを、この鋳型ｃＤＮＡの複数回のポリメラーゼ媒介転写によって増幅する（１ ２）。 RT-PCRにはいくつかのタイプがあり、定量の点で最も正確なものはリアルタイムRT-PCR法であり、RT-PCR反応中に誘導される蛍光を検出できる自動化されたシステムを必要とする(12)。 ＲＴ−ＰＣＲ中、ある遺伝子の発現は、「ハウスキーピング」遺伝子としても知られる構成的に発現される遺伝子と比較することによって推定することができる。

千の遺伝子の遺伝子発現レベルを同時に解析するcDNAマイクロアレイ技術は、Northern blotおよびRT-PCR解析の両方の原理と同じ原理に基づいています（7,8）。 本質的に、cDNAマイクロアレイは、チップまたはフィルター上のcDNAからそれらの対応する標的への遺伝子の数千人のハイブリダイゼーションです。 しかし、この技術の現在の課題は、ハイブリダイゼーション信号（13）の取得によって得られた生の数値データのかなりの量を分析することです。 調査の具体的な目的のために重要なデータを正確に処理するためには、計算および生物統計学的分析が必要です（図1）。

cDNAマイクロアレイマトリックスの製造

最近、いくつかの企業が特定の遺伝子発現プロファイルシステムに焦点を当てたcDNAマイクロアレーを設計し これらのマトリックスは、Ｓｕｐｅｒａｒｒａｙ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘを含むバイオテクノロジー企業によって、手頃な価格で使用するために市販されている。 このセクションでは、cDNAマイクロアレイマトリックスの生産の基本的な手順を説明しようとします。

cDNAマイクロアレイマトリックスを製造するための最初のステップは、基板上に印刷されるcDNA配列の全または部分的な断片の選択および増幅であり、その後、標的cDNA配列とハイブリダイズされる(14,15)。 シーケンスを選択する最も一般的な方法は、次のリソースに基づいています: 1)特定の遺伝子の機能および染色体の局在化についての情報を与えるUnigene、dbESTおよびGenBankのような遺伝子のデータバンク;2)商業企業のウェブサイトのホー 選択されると、cDNA断片は、マルチウェルマイクロプレート上のPCRによって増幅され、化学沈殿によって精製され、その後、ゲル電気泳動によって品質と量 PCRプロダクトはロボティック機械、microarrayerを使用してスライドか膜に印刷されます。 DNAのロボティック印刷、か沈殿の間に、毛管管は一定した圧力を受け取り、連続的にそれにより”マイクロアレイ”の設計（16）を作成するスライドか膜のDNAを、 ガラススライドおよびナイロン膜を含むさまざまなタイプの基質は、従って基質へのDNA配列の総付着の増加に終って疎水性充満を、増加するために前処理されます(13)。 最も重要なのは、基質に印刷された何千ものcDNAクローンの位置を含むデータ索引付けは、データベース分析用に設計されたソフトウェアを使用して各マイクロプレートの慎重なラベリングによって行われることである。 このデータベースには、クローンid（クローンID）、遺伝子名、染色体位置、および遺伝子機能も含まれています。

cDNAプローブと標的DNAマイクロアレイマトリックスとのハイブリダイゼーション

cDNAプローブと標的DNAマイクロアレイマトリックスとのハイブリダイゼーションを成功させるための重要な要因は、細胞または組織からのmRNAの品質に依存する。 ゲノムDNA、蛋白質、または洗剤の残余が付いている調査RNAの汚染物は偽陽性/偽陰性のデータで起因するかもしれません。

RNA配列の逆転写によるcDNA合成中のプローブの標識は、使用されているcDNAマイクロアレイの種類に依存する(16)。 一般に、ナイロン膜を基質としてcDNAマイクロアレイ分析を行う場合、プローブRNAは、逆転写のプロセス中にdCTP-P33ヌクレオチドの取り込みによって放射性標識される(7)。 ガラススライド上に印刷されたcDNAマイクロアレイの場合、放射性ヌクレオチド（17）およびシアンCy-3dUTPおよびCy-5dUTPなどの高効率取り込み速度を有する蛍光色素（8）が使用される。 CDNAマイクロアレイの種類とハイブリダイゼーションプロセス(7,8,17-20)の詳細については、表1を参照してください。

cDNAマイクロアレイ技術を用いた遺伝子発現パターンの同定のための解析ツール

cDNAマイクロアレイから生成された膨大な量のデータを解析するための 現在、研究者らは、多様なソフトウェアプログラム（21-24）を使用してcDNAマイクロアレイデータを分析 これは、この技術を使用して得られた膨大な量のデータを分析するための単一の方法がないことを意味します。 生物統計学的ツールの使用は、遺伝子発現プロファイルの重要性を分析する上でますます重要になってきています。

cDNAマイクロアレイデータを分析するために使用される方法のいくつかのタイプについての一般的なアイデアを提供するために、我々は分析プロセス 最も重要なのは、複数の複製実験を完了することによって結果を検証することです。 ハイブリダイゼーション信号を取得した後，基板を計算プログラムを用いて視覚的に調べた。 この場合、基板の品質が考慮される。 例えば、ファジィスポット画像、色素沈殿物、または強い背景信号を有するサンプルは、通常、廃棄される。 この分析は、偽陽性信号の検出をもたらす可能性のある人工物を排除するために重要である（16）。 種々の研究者は，ハイブリダイゼーション信号のバックグラウンド減算の方法をバックグラウンドでの非特異的信号に適用した。 このステップでは、使用するソフトウェアに応じて、次の2つの方法でバックグラウンド信号を減算することができます: 1)基板内のスポットの正の信号間の信号強度に起因する算術平均または中央値によって、または2)特定の遺伝子信号に対応する各スポットの直 これらの２つの方法によって、算術平均値または中央値が、差動的に発現された遺伝子を表す正のシグナルから減算される（１ ６）。 特定のソフトウェアを使用して作成された局在化の格子の肯定的な信号強度の獲得はアルゴリズムとして知られている任意価値で完了する。 これらの値は、基質に印刷された各遺伝子の以前にカタログ化された情報を含むデータベースソフトウェアで直接アクセスすることができます。

同時に解析される遺伝子の膨大な量と、cDNAマイクロアレイ技術のすべての技術的ステップにおける変動性のために、データ正規化プロセスを介して行われる調整または補償の因子を作成することが重要である。 基質上の非特異的シグナルの存在、ハイブリダイゼーション前のRNAの量または品質に関連する問題、またはRNAのプローブ取り込みの可変性は、すべてのサン データの意味のある解釈のために、正規化プロセスは、個々のグループからのアルゴリズムの算術平均の比較分析を、コントロールとして頻繁に選択される別のものと比較分析を実行する（24,25）。 正規化方法にはいくつかの種類があり、最も適切な方法を選択するのは難しい場合があります。 この理由は、複数の実験変数は、多くの場合、データの評価を汚染する偽陽性/偽陰性の結果なしに差動発現遺伝子の正確な同定を妨げるためです。 数学的、統計的、およびバイオインフォマティックサポートは、cDNAマイクロアレイ技術のこの段階で重要です。

正規化方法には、1)基質上にあるすべての正の信号から得られた平均、中央値、中央値の差、または分散に基づいて、異なるグループ間の測定された発現レベ; 2)相関係数またはユークリッド距離を介して評価され、同じグループの異なるサンプルの信号強度に対応するアルゴリズムによって表される分布に基づ さらに、蛍光アレイに頻繁に使用される局所的に重み付けされた線形回帰（lowess）正規化法は、強度ハイブリダイゼーションシグナルの変化とスライド上のスポッ

正規化後、遺伝子発現のパターン間の違いを特定する最も簡単な方法は、サンプルとその適切な対照との比差を使用することです。 この場合、任意の限界が確立され、この値からデータベースソフトウェアを使用して差動発現遺伝子を選択することが可能である。 例えば、発現レベルの有意な変化を有する遺伝子を同定するために、２倍の閾値を確立することが可能である。 このプロセスの間に、この範囲内の遺伝子が選択され、データベース内にある表に編成される。 選択基準を満たす遺伝子は、自己組織化マップ（28,29）を示すソフトウェアを使用してデータベースから視覚化することができます。 さらに、異なるグループ間の遺伝子発現プロファイルのこれらの変化は、階層クラスタリング解析（25,29,30）に基づいて樹枝図で視覚化することができます。 この場合、ダウンレギュレートされた遺伝子は一般に緑色で示され、アップレギュレートされた遺伝子は一般に赤色で示される。 遺伝子調節の違いがより強いので、そのそれぞれの色も同様です。 CDNAマイクロアレイデータを分析するためのソフトウェアプログラムは、インターネッ

cDNAマイクロアレイ技術によって取得された遺伝子発現プロファイルの解析には、何千もの遺伝子が同時に解析されることに注意することが重要 選択された遺伝子の生理学的研究を行う前に、cDNAマイクロアレイの結果は、ノーザンブロット分析またはリアルタイムRT-PCRによってRNAレベルで確認されるべきである(14)。 これは、同じ遺伝子ファミリー内の遺伝子間のクロスハイブリダイゼーションによる偽陽性cDNAマイクロアレイの結果の可能性を排除します。 それ以上の確認はまた西部のしみの分析、流れのcytometryまたはimmunohistochemistryによって蛋白質のレベルで、のような強く推奨されています。 この文脈では、組織マイクロアレイアッセイ（31-33）を使用してタンパク質レベルで遺伝子を評価することが現在可能である。 組織マイクロアレイアッセイは、特定のマーカーを使用して一度に千までの組織の評価を可能にする方法です。 基本的には、1mm以下の小さなコア生検は、特別な金属デバイスまたは針で個々のパラフィン包埋組織ブロックから単離され、配列された方法で別のパラ この技術の利点は次のとおりです:1)配列を組み立てるためにバイオプシーのために得られる元のティッシュの標本の経済そして保存; 2)従って配列が単一のガラススライドで組み立てられるので技術的な問題を避けるためには、洗浄を促進し、技術的なプロセスを汚すこと、および3)複数のティッシュの標本でその場で分析を同時に行う速度。 臨床的に、それは病理学的状態（31,32）に対する診断、予後および治療ツールとしての潜在的な使用のための新規バイオマーカーを同定するためにcDNAマイクロア

: アプリケーションと視点

アプリケーションの面では、cDNAマイクロアレイ技術は、特定の遺伝子の同定につながり、研究者は、様々な生物における正常と病 基礎科学では、cDNAマイクロアレイは、例えば、正常細胞培養とトランスフェクト細胞培養との間の遺伝子発現パターンの比較を通じて、細胞分化などの細胞プロセスに関与するいくつかの遺伝子の役割を同定するために使用されている（34）。 多くの研究グループは、異なるタイプの癌だけでなく、感染症の病因を研究するためにcDNAマイクロアレイ技術を使用してきました（35-40）。 この場合、新規遺伝子の同定や、非罹患状態から罹患状態への組織における遺伝子発現パターンの変化は、疾患の発症および進行を制御する分子機序をよりよく理解することに貢献している。 さらに、cDNAマイクロアレイは、製薬業界で非常に興味深い方法論と考えられています。 この文脈では、別個の薬物試験に提出された大規模な細胞における遺伝子発現プロファイルの分析は、治療的使用のための潜在的な薬剤を分類する 基本的および臨床科学におけるcDNAマイクロアレイ方法論の適用のいくつかの例（34-48）は、表2に記載されています。

cDNAマイクロアレイ解析はコストのかかる方法論ですが、この技術から生成される豊富な結果は疑いの余地のないペイオフです。 この方法論の開発のための中央研究ユニットが組織されると、様々な研究者は、生物学的および臨床的領域の両方で差動発現遺伝子を調査するために、前に印刷されたcDNAマイクロアレイ基板を使用する利点を享受することができます。 CDNAマイクロアレイユニットの組織のために、数学的および生物学的アリーナ間の学際的な相互作用を考慮する必要があります。 CDNAマイクロアレイユニットのインフラストラクチャを示す簡単な仮想的な模式モデルを図2に示します。

最後に、cDNAマイクロアレイ技術によって分析された遺伝子発現プロファイルのデータを含む集中型バンクが作成され、インターネット（49,50）を介して検査 このようにして、世界中の異なるグループは、選択された遺伝子プロファイルのデータを、European Bioinformatics Institute（51）によって設計されたGene Expression OmnibusやArray Expressなどの分子データバンクに寄託された他のものと比較することができるようになる。

cDNAマイクロアレイ技術を用いた様々な研究グループ間の有益な相互作用が制限されている問題は、結果を提示し、交換するための基準がないことです。 この苦境を補うために、マイクロアレイ実験（MIAME）の注釈のための最小限の情報が作成された（52）。 CDNAマイクロアレイ実験の標準化につながるガイドラインは、マイクロアレイ遺伝子発現データ協会（MDED）によって提案されています。 MIAMEは基本的に六つのセクションで構成されています:1)実験設計;2)配列設計; 3)使用されるサンプル、抽出物調製物、およびハイブリダイゼーション;4)ハイブリダイゼーションの手順とパラメータ;5)画像、定量化、およびパラメータ測定、および6)正規化コントロールの種類、値、および仕様。 MIAMEは、多くの科学雑誌にcDNAマイクロアレイの結果を公開するための要件となっています。 さらに、MDED、Rosetta、Agilent、Affymetrixなどの異なるグループは、cDNAマイクロアレイ技術を使用して異なる研究グループ間の通信を可能にする共通の柔軟な構造プラットフォームであるマイクロアレイ遺伝子発現（MAGE）を設計するためにバイオインフォマティクスを使用して協力してきました。 MAGEは、1)mage-ON(object model)、統一モデリング言語を使用し、MIAME要件を実装する中心データモデルで構成されています; 2)MAGE-OMからXMLベースのデータ形式への翻訳を文書化するmage-ML(markup language)、および3)mage-SLKは、mage-OMへのアプリケーションプログラマインタフェースを定義し、MAGE-MLへのデータエクスポートを可能にし、その後リレーショナルデータベースにデータを格納する自由にアクセス可能なソフトウェアである(53)。

最近、ナノテクノロジーは、現代の科学的進歩を改善するために、産業、製薬、政府のアプリケーションなど、さまざまな分野で広く実装されています。 ナノ粒子のユニークな物理的および化学的特性のために、これらの材料は、感覚装置、推進添加剤、組織リモデリング技術、および薬物標的機構を強化する さらに、ナノテクノロジーは、マイクロアレイ能力（54）を改善し、タンパク質ナノアレイ（55）の開発を支援するために利用されている。 実験室の設定の中で、科学者たちは現在、ナノ粒子がマイクロアレイ技術（56）を使用して細胞内の遺伝子の誘導/阻害に及ぼす潜在的な正/負の影響を調 最後に、ナノテクノロジーとマイクロアレイ技術の組み合わせは、疾患プロセス（57,58）の間に差動的に調節される遺伝子の現在の知識を進めてきました。

これらのツールは、多様なゲノムにおける新規遺伝子機能の理解と、それらがヒトの疾患病因とどのように相関するかの理解に貢献することがで CDNAマイクロアレイ技術の開発と応用は、薬物の発見、研究診断、および様々な疾患の治療に向けられた潜在的な遺伝子治療に多くの進歩をもたらしました。 この基盤技術は、研究者が複数の多様な生物学的プロセスに関与する分子機構を理解するのに役立ちます。

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対応と脚注