원발성 세포,특히 줄기세포 개체군의 분리 및 장기 확장은 발달생물학 및 줄기세포 생물학,의학 등 다양한 생물분야에서 근본적이고 중요한 기본 기술이다. 층 화 및 원주 상피 조직에서 세포는 높은 재생 및 많은 인간의 암;에 대 한 불균형 적으로 책임 그러나,성인 줄기 세포를 복제 미 숙 상태에서 이러한 세포를 유지 하는 어려움에 의해 제한 됩니다. 최근 몇 년 동안,기술 혁신은 조직 틈새 환경을 모방하고”유기체 배양”을 촉진하는 작은 분자 및 성장 인자의 사용과 같은 줄기 세포 생물학에서 신속하고 극적인 진전을 가져 왔습니다.
1975 년 라인발트와 그린은 인간 각질 세포를 이용한 인간 성체 줄기 세포 배양의 첫 번째 성공적인 사례를 확립했다. 특히,그들은 살상 조사 된 마우스 섬유 아세포 세포주와 함께 인간 각질 세포를 장기간 유지했습니다. 그들은 3 티 3 세포에서 자란 복제 된 각질 세포에”줄기 세포”라는 용어를 사용하지 않았지만 녹색과 동료들은 통과 후 새로운 콜로니를 분열시키고 형성 할 수있는 놀라운 능력을 가진 콜로니를 발견했으며,이를”홀로 클론”이라고 불렀습니다. 이 홀로 클론은 작고 미성숙 한 세포로 구성되어 있으며,모두 층화 된 상피 세포에서 줄기의 마스터 조절기 인 피 63 과 함께 강렬한 핵 염색을 보였다. 피부,폐 기관지,유선 및 방광 요로텔륨을 포함한 층상 상피에서 줄기 세포 집단은 주로 기저층에 국한되었으며 미성숙 세포는 시험 관내 연구와 일치하여 염색되었습니다. 크게,자가 피부에서 분리되고 확장 된 인간 각질 세포는 환자를 태우기 위해 성공적으로 이식되었으며 분할 두께 피부 이식에서 그 결과를 닮은 영구적 인 표피를 재생했습니다. 특히,동일한 절차를 분리 하 고 이식에 대 한 인간의 각 막 상피 세포를 확장 적용 되었습니다. 이 기술은 그 당시 표피와 각막의 줄기 세포로 제한되었지만,녹색 및 동료들은 기본적인 생물학 및 재생 의학 분야에서 인간의 성체 줄기 세포를 복제하기위한 기반을 만들었습니다.
이 리뷰 문서에서 우리는 최근 연구 진행 및 상피 세포 기술에 기술 혁신을 주도 하고있다 세포 배양 시스템의 축적 증거의 개요를 제공 합니다. 층 화 상피 세포와 원주 상피 세포에 대 한 새로운 문화 전략 인간의 상피 개발 재검토 될 수 있도록 하 고 체 외에서 인간의 질병 모델을 생성 하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 또한 재생 의학에 대 한 정상적인 상피 세포 배양 기술의 가능성과 가능한 응용 프로그램을 논의 하 고 개별 환자 고기 재현 암 세포 배양 시스템을 강조 표시 합니다.
층상 상피 세포 배양
선상 및 가성 층상 상피를 포함한 층상 상피 조직에서,기저막에 국소화 된 63+세포는 줄기/전구 개체군을 유지하고 기능적 조직을 형성하는 자손을 생성하기 위해자가 갱신 할 수있다. 위에서 언급 한 바와 같이,피부 각질 세포 및 각막 상피 세포와 같은 상피 줄기 세포의 복제 및 확장은 조사 된 마우스와의 공동 배양 시스템에서 잘 확립되어왔다. 그러나,이 표준 프로토콜은 주로 각질 세포 및 각막 세포의 장기 배양으로 제한되었습니다. 그럼에도 불구 하 고,흉선 상피에서 복제 된 줄기 세포 보고 되었습니다. 또한,프레이와 동료 최근 소닉 고슴도치를 표현 하 고 방광 요로텔의 기초 층에 거주 하는 요로텔의 줄기 세포를 분리 하는 3 톤 3 피더 방법을 적용 했다. 2013 년 12 월 31 일,2013 년 12 월 31 일,2013 년 12 월 31 일,2013 년 12 월 31 일,2013 년 12 월 31 일,2013 년 12 월 31 일,2013 년 12 월 31 일,2013 년 12 월 31 일,2013 년 12 월 31 일,2013 년 12 월 31 일,2013 년 12 월 31 일,2013 년 12 월 2011 년 푸자 외. 세 가지 유형의 인간기도 상피 줄기 세포를 분리하기 위해 3 티 3 배양 시스템을 이용했습니다. 미숙 한 줄기 세포 클론은 형태 학적으로 구별 할 수없는 것으로 나타 났으 나,이들의기도 상피 줄기 세포는 시험 관내 분화 후 뚜렷한 세포 표현형을 나타냄을 발견했다(그림 1). 1) . 후속 연구에서 마우스 기관 및 원위 기도 상피 줄기 세포의 이식 원위 기도 줄기 세포 인플루엔자 손상 된 폐 조직에 쉽게 통합 하 고 여러 상피 세포 유형으로 분화,즉 시연 했다. 이식 된 기관 줄기 세포는 주요기도에서만 국소화 된 반면,세기관지 및 폐포. 클론 생성 줄기 세포는 또한 인간 식도 내시경 생검 샘플에서 분리되었으며,이들 세포는 공기 액체 계면(알리)배양 시스템에서 잘 분화되고 층화 된 편평 상피 유사 구조를 형성 할 수있었습니다.
3 티 3 마우스 피더 층에 인간 층 화 및 원주 상피 줄기 세포에 대 한 세포 배양 과정의 개략도. 층화 된 상피 줄기 세포의 경우,생검에서 분리되거나 수술 표본은 장기 배양을 위해 3 층 3 층에 도금됩니다. 원주 상피 줄기 세포를 위해,그들은 줄기 세포 성장과 정비를 위해 근본적 인 정의한 요인을 가진 3 티 3 층에 도금됩니다. 상피 줄기 세포의 형태 학적으로 미성숙 한 콜로니(작은 세포가있는 포장 된 콜로니)는 더 균질 한 확장을 위해 기계적으로 픽업됩니다. 알리 문화에서 셀 트랜스 웰에서 성숙한 세포 유형으로 분화를 받 다
슐레겔과 동료들은 로-관련 단백질 키나아제(암석)억제제가 3 티 3 피더 세포와 함께 인간 각질 세포,전립선 세포 및 유선 세포를 포함한 상피 줄기 세포의 증식 능력을 크게 증가 시켰으며,이 현상을”조건부 재 프로그래밍”이라고 불렀다. 환자의 상피 줄기 세포 배양을 효율적으로 생성 할 수있는 능력은 세포 기반 진단 및 치료제에 대한 중요하고 가치있는 통찰력을 제공합니다. 더 최근에,Rajagopal 및 동료에게 보여주었 TGFß/BMP/SMAD 신호 통로 중요한 각종에서 상피 조직을 포함하여 외배엽-파생된 피부와 유선 조직,하 파생한 식도 및 전립선 조직 및 mesoderm 유래 생산. 2013 년 12 월 31 일,2013 년 12 월 30 일,2013 년 12 월 30 일,2013 년 12 월 30 일,2013 년 12 월 30 일,2013 년 12 월 30 일,2013 년 12 월 30 일,2013 년 12 월 30 일,2013 년 12 월 30 일 놀랍게도,이중 TGFß/BMP 억제 활성화한 확장의 상피의 줄기세포에 대한 필요없이 마우스 3T3 공급 세포입니다.
총체적으로,작은 분자 및 피더 세포와 함께 이러한 기술적 진보는 체외에서 층화 된 상피 줄기/전구 개체군을 지속적이고 효율적으로 확장시키는 데 사용될 수있다. 층상 상피 배양의 또 다른 돌파구 인 오가 노이드 배양은 기초 및 내강 인간 전립선 조상을 확장하는 데 활용되었습니다. 이 인간 내강 조상은 다 능성이었고 시험 관내에서 전립선과 같은 구조를 형성했습니다. 그러나,본격적인 생체 조건 아키텍처를 요약 하기 위해 층 화 또는 가성 상피로 구성 된 3 차원 구조를 생성 남아 도전,비록 많은 연구자 회전 타원체 및 오가 노이드 문화 보고. 이 문제는 다 능성 줄기 세포 유래 조직에서 수행되는 것처럼 자기 조직을 촉진하는 방법을 확립함으로써 해결 될 수 있습니다.
원주 상피 세포 배양
장 줄기 세포 장 상피를 유지 하기 위해 높은 회전율 증식 하는 놀라운 능력을 보유 하 고 간세포는 손상에 대 한 응답에서 높은 재생,원주 상피 세포에서 줄기 세포 개체군을 복제 하는 능력은 심각 하 게 제한,아마도 조직 틈새 신호 체 외에의 부족으로 인해. 클레버와 동료들은 지난 10 년간 장 줄기세포 마커인 류신이 풍부한 리피트-함유 지-단백질 결합 수용체 5)를 정교한 마우스 모델에서 발견하였고,여러 장의 세포 유형을 가진 융모와 같은 구조와 토굴과 같은 영역으로 구성된 마우스 장 유기체 배양 방법을 확립하였다. 성장 인자와 작은 분자 칵테일과 함께,격리 된 줄기 세포 분획을 마 트리 겔에 현탁 하 고 장기 배양 했다. 수용체 억제제,소장 및 결장으로부터 분리 된 인간 상피 세포는 시험관 내에서 장기간에 걸쳐 무한히 확장 될 수 있었다. 이 기술은 췌장 덕트 세포 및 간세포와 같은 다른 유형의 세포를 배양하는 데 적용 할 수 있으며 원주 상피 세포 배양의 혁신적인 발전을 촉진합니다.
유기체 배양은 마트리겔 기반의 3 차원 배양 플랫폼을 사용하며,줄기/전구 세포 집단과 함께 층상 상피 세포를 포함한 다양한 유형의 성체 상피 세포를 안정적으로 배양하는데 광범위하게 사용될 수 있다. 그러나,신속 하 고 효율적으로 균일 한 줄기 세포의 일부를 생 체 외 전파 하는 능력은 또한 유용 하 고 조직 줄기 세포와 재생 의학에 대 한 세포 이식의 가능한 미래 응용 프로그램에서 자기 갱신 및 운명 사양에 대 한 자세한 연구에 대 한 중요 한. 시안과 동료들은 최근 소장 및 결장 세포를 포함한 인간 태아 장 줄기 세포의 균일 한 확장을위한 새로운 배양 시스템을 개발했다. 이 시스템은 인간 원주 상피 줄기 세포를 견고하게 확장하기 위해 성장 인자 및 신호 경로 억제제와 함께 3 티 3 마우스 피더 층을 사용했습니다(그림 1). 1) . 또한,3 티 3 섬유 아세포에서 자란 장 줄기 세포의 50%이상이 식민지를 형성 할 수있었습니다. 포유 동물의 장에서 정의 된 틈새 요인,와 같은 노치 신호,토굴 기지에서 장 줄기 세포의 줄기 세포를 관리하기위한 필수적이다. 또한,토굴 기지에 위치한 판네스 세포는 줄기 세포에서 발생하며 파라 크린 방식으로 필수 요소를 제공함으로써 줄기 세포 틈새 역할을합니다. 유기체 배양은 줄기 세포와 판네스 세포와 같은 다양한 유도체로 구성되기 때문에 틈새 인자가 자율적으로 공급됩니다. 대조적으로,장 줄기 세포의 순수한 개체군이 3 티 3 피더 층에서 자라기 때문에 세포는 틈새 요인을 분비 할 수 없습니다. 따라서 틈새 요인과 유사한 외적 요인을 보완해야합니다. 줄기 세포 유지 관리 프로토콜 외에도 분화 프로토콜은 알리 배양 모델에서 적어도 4 가지 유형의 주요 장 세포,즉 파 네스 세포,장 내분비 세포,잔 세포 및 장 세포(장 흡수 세포)를 발생시키기 위해 확립되었습니다. 소장 및 결장 조직과 같은 원래 조직 유형에 따라 장 융모 유사 구조의 형성이 관찰되었습니다(그림 2). 1). 다른 알리 문화 접근,쿠오 및 동료 견고 기질 요소 장기 마우스 신생아 장의 작은 조각을 배양.
내시경 생검에서 얻은 인간 위 줄기 세포를 복제하는 데에도 동일한 전략이 적용되었습니다. 특히,클론 성 위 세포는 성장 인자 및 작은 분자와 함께 3 티 3 피더 층에서 안정적으로 확장되었고,펩시 노겐 발현 수석 세포와 같이 일반적으로 위장에서 발견되는 위 상피 계통으로 분화되었다. 복제 된 소화 기관 줄기 세포 뿐만 아니라 원위 자 궁 관에서 난관 전구 세포 또한 무한 하 게 틈새 요인의 존재에서 3 티 3 피더 층에 전파 수 있었다. 원위 난관,핌브리아 상피는 다음과 같은 두 가지 유형의 세포로 구성된 단순한 원주 상피 층입니다: 배우자의 수송을 향상시키는 섬모 세포와 점액을 분비하는 분비 세포. 장 줄기 세포에 대 한 차별화 프로토콜의 약간의 수정을 사용 하 여,장기 알리 배양 난관 줄기 세포는 생체 조건 상피 구조를 연상 했다 섬모 및 분 비 세포를 포함 하는 3 차원 아키텍처에 상승 했다. 줄기 세포 인구에서 적절 한 세포 종류와 상피 계보를 생산 하는 기능 생리 적 상피 개발 및 항상성 연구 및 체 외에서 급성 및 만성 질환 모델을 개발 하는 유용한 도구가 될 수 있습니다.
암세포 배양
1951 년 자궁경부암 환자로부터 최초의 암세포주인 헬라세포주가 설립된 이래,다양한 종류의 암세포주가 암의 병리생물학을 연구하는데 널리 사용되어 왔으며,생체 내 이종 이식 모델을 생성하고 체외 및 생체 내 항암제를 시험할 수 있는 기회를 제공하였다. 암 세포 라인을 사용 하 여 암 생물학에서 엄청난 발전 되었습니다,비록 이러한 세포를 사용 하 여 얻은 결과 충분히 암 전시 환자 간 및 종양 내이 질,차세대 시퀀싱의 최근 발전에 의해 밝혀 때문에 원래 예상 대로 질병의 복잡성을 반영 하지 않을 수 있습니다. 암 표현형,환자의 유전자 돌연변이 상태 및 병 리를 포함 하 여 더 정확 하 게 반영 하기 위해,웰름 및 동료 개발 환자 파생 된 이종 이식 비 노 베제 당뇨병 심한 결합 된 면역 결핍(끄 더-스키드)마우스 원래 종양의 필수적인 기능을 유지 하 고 특정 사이트에 전이성 용량 전시. 유방암 모형 이외에,단단한 종양의 각종 모형의 설립은 새로운 암 치료의 전임상 테스트를 가속하고”개인화한 약”의 목표를 깨닫는 것을 도울 것으로 예상되는의학 모형의 실행가능을 설명했습니다.
유기체 및 피더 시스템과 같은 성체 줄기 세포에 대한 배양 방법은 환자 유래 암 세포를 사용하는 다른 접근법에도 적용 가능하다. 특히,클레버와 동료들은 유기체 배양이 췌장,전립선 및 대장 암을 모델링하는 데 사용될 수 있다고보고했으며 유전 적 이질성 및 약물 민감성을 포함한 원래의 암 특성을 재구성 할 수 있음을 보여주었습니다. 따라서 그들은이 시스템을”살아있는 유기체 바이오 뱅크”라고 불렀습니다. 이러한 기술은 또한 바렛 식도,인간의 식도 선암의 전구체로 전암 병변에서 줄기 세포 인구를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 바렛 식도의 줄기세포는 식도세포의 일부분이며,식도의 줄기세포는 식도의 줄기세포로 분리되고 확장된 바렛 식도의 줄기세포로 분리된 바렛 식도의 줄기세포로 분리된 바렛 식도의 줄기세포로 분리된 바렛 식도의 줄기세포로 분리된 바렛 식도의 줄기세포로 분리되었다. 예상대로,바렛 식도 줄기 세포는 마우스에서 식도 선암과 같은 종양으로 변형되었습니다. 유사한 접근은 인간 난관 줄기 세포가 고급 장액 난소 상피암에 있는 근원의 세포이었다는 것을 설명했습니다. 이 발견은 최근 인간의 병 리와 원위 난관 상피가이 암에 대 한 기원의 조직 표시 유전자 변형 마우스 모델 증거를 확증. 대장암에서 흔히 발견되는 드라이버 돌연변이를 도입하여 정상 결장 줄기세포를 순차적으로 변형시켰다. 결과 셀 신장 캡슐에 이종 이식 양식을 허용 하 고 선 암 같은 표현형 침략 적 및 전이성 속성에 의해 특징으로 진보적인 변환을 전시 했다. 전반적으로,종양 및 환자 일치 정상적인 상피 조직에서 세포를 분리 하 고 문화 능력 뿐만 아니라 암 생물학 분야에서 고전적인 생체 조건 동물 작업을 보완 하지만 또한 환자 특정 유전학 및 유전체학 접근 체 외 용이 하 게 하는 플랫폼의 생산을 용이 하 게 합니다.
성체 줄기 세포를 이용한 염증 질환 모델링
인간 질환 모델링은 인간 병 조직의 제한된 접근 가능성에 의해 방해 받는다. 그럼에도 불구 하 고,성체 줄기 세포 재배의 발전 줄기 세포를 확장 하 고 작은 인간 생 검 샘플에서 성숙한 세포 유형을 파생 하 여 체 외에서 질병 표현형을 재현할 수 있다. 알리 및 유기체 배양과 같은 3 차원 배양 방법은 여러 세포 유형으로 구성되고 생체 내에서 관찰 된 상피 구조와 유사한 구조를 제공하기 때문에 감염성 및 유전성 질환을 포함한 염증성 질환을 연구하는 데 적합해야합니다. 특히,질병 표현형을 재현하는 것은 병원체(또는 주요 원인)및 표적 세포 유형이 알려진 경우 간단합니다.이 경우,대장염 치료 후 10-15 일 동안 지속되며,10-15 일 동안 지속되며,10-15 일 동안 지속되며,10-15 일 동안 지속되며,10-15 일 동안 지속되며,10-15 일 동안 지속되며,10-15 일 동안 지속되며,10-15 일 동안 지속되며,10-15 일 동안 지속될 수 있습니다. 디피실린은 그람 양성 포자 형성 박테리아이며,고 분자량 독소를 생성하여 체액 분비,염증 및 결장 조직 손상을 유도합니다. 알리 배양에서 클론 성 결장 줄기 세포와 차별화 된 결장 상피 세포는 시간 및 용량 의존적 인 방식으로 파괴적인 상피 손상을 일으키는 이러한 독소로 도전 받았다. 이 결과 3 차원 문화 모델 다 디피 병 리를 나타내는 데 사용할 수 있습니다 표시. 이와 유사하게,헬리코박터 파일로리(헬리코박터 파일로리)감염의 효과는 만성 위염,위궤양 및 암을 유발하는 것으로,파일로리를 유기체 배양에 미세 주입함으로써 연구되었다. 박테리아 감염 된 오가 노 이드 문화 전시 증가 염증,및 발현 글 랜드 유형 오가 노 이드 문화 구 덩이 유형 오가 노 이드 문화 보다 훨씬 더 높은 했다.
성체 줄기 세포는 또한 유전 질환을 모델링하는 데 사용되었습니다. 비크 만과 동료들은 낭포 성 섬유증(참조)환자에서 파생 된 장 유기체 배양을보고했다. 이것은 일반적으로 폐 및 소화 조직과 같은 많은 기관의 상피 세포에서 발현되는 낭포 성 섬유증 막 횡단 컨덕턴스 조절제의 돌연변이에 의해 발생합니다. 정상 장 오가 노이드 배양 포스 콜린에 대한 응답으로 강력한 부종을 전시하지만,부종 반응은 오가 노이드 배양에서 관찰되지 않았다. 또한,변이된 유전자좌가 환자의 장내 유기체에서 크리스퍼/카스 9 기술을 사용하여 교정되었을 때,교정된 유전자는 기능적으로 작동하는 것으로 나타났다. 따라서,성인 줄기 세포의 체 외 분화,생체 조건 표현형 유전자 편집 기술과 함께 여러 세포 유형을 닮은 인간의 질병을 치료 하기 위한 강력한 수단을 제공 하 고 인간의 병 리에 대 한 직접적인 통찰력을 제공할 수 있습니다.
재생의학을 위한 상피줄기세포의 응용
인간배아줄기세포와 유도만능줄기세포를 재생의학에 응용하기 위한 유망한 전략에도 불구하고,이들 전략의 임상시험은 거의 진행되지 않고 있으며,이는 부분적으로 혈통 규격의 어려움과 종양발생 가능성에 기인한다. 성체 줄기 세포는 본질적으로 특정 조직 유형에 전념하기 때문에 의도 된 세포 유형을 생산하는 것은 비교적 쉽고 종양 발생의 잠재적 위험은 낮습니다. 따라서,치료 방법은 이식 세포 소스로 성체 줄기 세포를 사용하는 것을 목표로하고 있습니다. 그린과 동료들이 1975 년에 인간 각질 세포 배양 방법을 확립했고 배양 된 세포는 화상이나 화학적 부상을 입은 환자에게 이식 할 수 있었지만 다른 유형의 성체 줄기 세포를 장기간 재배하는 것은 중요한 기술적 장벽의 대상이었습니다. 위에서 설명한 바와 같이,최근의 기술적 진보는 다양한 유형의 상피 세포에 대한 이러한 제한을 극복했습니다. 따라서,신속하고 효율적으로 줄기 세포 인구를 확장 할 수있는 능력은 재생 의학에서의 사용에 대한 가치가있다.
예를 들어,쥐 결장 줄기 세포는 유기체 배양으로 확장되어 손상된 쥐 결장에 이식되었으며,25 주 후에도 자기 재생 및 분화 할 수있는 이식 된 세포가 검출되었다. 다른 접근 방식에서,장 케이와 동료들은 이식 연구를 위해 설계 성체 줄기 세포를 무력화. 첫째,그들은 피더 세포가없는 접시에서 각막 상피 세포를 성공적으로 배양 한 다음 각막 줄기 세포를 피부 각질 세포와 구별하는 핵심 전사 인자라는 것을 발견했습니다. 놀랍게도,각질 세포에서의 6-과발현은 림프 줄기 세포 유사 세포를 유도했으며,이들 세포는 손상된 토끼의 각막에 이식 될 수있다. 각질 세포는 중추 신경계보다 더 쉽게 접근 할 수 있기 때문에,이 방법은 인간의 눈 질환의 치료에 적용 할 수있다. 최근,리우 등. 내인성 줄기 세포를 사용하는 조직 복구 및 재생에 대한 매력적인 접근 방식을보고했습니다. 그들의 연구에서 렌즈 상피 줄기 세포(렉 스)를 표현 하는 팍스 6 과 생체 조건 1 특성 및 생체 조건 재생 잠재력을 전시 했다. 내인성 렉을 보존하는 외과 백내장 제거 방법이 사용되었으며,이 렉은 토끼,원숭이 및 인간 유아의 시각 기능을 가진 렌즈의 자발적인 재생에 기여했습니다. 이 방법은 백내장 치료를위한 치료 적 돌파구가 될 수 있으며 잠재적으로 인공 안구 내 렌즈 이식을 대체 할 수 있습니다.
많은 상피 세포의 높은 회전율 때문에 이식 줄기 세포 개체군은 장기 조직 유지에 필수적입니다. 이론적으로 단일 줄기 세포는 전체 조직을 재구성 할 수 있으며 여러 연구 그룹이 경험적으로이 개념을 시연했습니다. 모든 세포 유형을 야기 할 수있는 만능 줄기 세포의 잠재력에도 불구하고,생체 외에서 미성숙 상태로 유지 될 수 없다. 따라서 재생 의학에 성체 줄기 세포를 사용하는 것은 상당한 이점을 제공합니다.