PMC

HCV RNA-kvantifisering.

målet med denne studien var å utvikle en enkel QRT-PCR-analyse i sanntid for kvantifisering AV HCV RNA i både serum – og leverprøver med SYBR Green i-deteksjon i stedet for bruk av merkede prober. Sanntids qrt-PCR-analyser ble utført Med En LightCycler (Roche) med både single-round forsterkning og en ny begrenset syklus nestet forsterkning. RNA-standarder ble transkribert Med T7-polymerase fra amplikoner avledet fra 5 ‘ uoversatt REGION PCR-produkter klonet til pGEM-T Easy (Promega) og behandlet to ganger med Rq1 DNase. RNA ble kvantifisert ved spektrofotometri. For enkelrund kvantifisering av serumprøver ble RNA omvendt transkribert som beskrevet tidligere (7). FOR nestet PCR-kvantifisering med begrenset syklus ble EN RT-PCR utført i en ett-trinns reaksjon med 15 sykluser AV PCR (trinnet med begrenset syklus), etterfulgt AV en qrt-PCR i sanntid. HCV-belastninger ble målt ved sanntids PCR MED ytre primere KY78 OG KY80 FOR enkeltrunde reaksjoner (21) eller ytre primere pluss indre primere hep21b og hep22 for nestede reaksjoner med begrenset syklus (19). Reaksjonsblandinger inkluderte 2 µl Av Fast Start DNA Master SYBR Green I (Roche), 4 mM MgCl2, en 0,5 µ konsentrasjon av hver primer og 2 µl av malen i et totalt volum på 20 µ. Etter inkubasjoner i 10 min ved 95 hryvnias C ble LightCycler PCR utført i 40 sykluser, hver syklus bestående av 15 s ved 95 hryvnias C, gløding ved 60 hryvnias C i 5 s og forlengelse ved 72 hryvnias C i 10 s. Fluorescens ble overvåket ved 530 nm, og signalets spesifisitet ble kontrollert ved å smelte kurveanalyse.

med syntetisk HCV RNA som mal, var følsomheten til qrt-PCR-analysen i SANNTID i enkeltrunde omtrent 103 HCV-kopier / reaksjon eller 5 × 104 kopier / ml når fortynningsfaktoren ble beregnet. Det ble observert et bredt lineært forhold (opptil 6,5 × 108 kopier/reaksjon) mellom ANTALL PCR-sykluser som trengs for å oppdage et fluorescenssignal og ANTALL HCV-kopier. Vi målte serum viral masse 24 pasienter kronisk infisert med ULIKE HCV genotyper utbredt I Australia (1a, 1b, 2a, 2b, 2c, og 3a) (6). Tre pasienter hadde virusmengde under sensitiviteten til denne versjonen av analysen (5 × 104 kopier/ml), selv om de var positive ved en kvalitativ intern nestet RT-PCR-analyse (19). De resterende 21 pasientene hadde virusmengde som varierte fra 2,8 × 105 til 9,1 × 106 kopier / ml. For å øke sensitiviteten og spesifisiteten til analysen ble en 15-syklus, ett-trinns RT-PCR introdusert med en etterfølgende sanntids kvantitativ PCR for andre runde. Med syntetisk RNA var den modifiserte metoden i stand til å oppdage ET bredt spekter AV HCV-kopieringsnumre (fra 28 til 2,8 × 106 HCV-kopier/reaksjon) samtidig som lineariteten opprettholdes. Sensitiviteten til DEN nestede qrt-PCR-analysen med begrenset syklus var større enn 28 kopier/reaksjon (eller 1400 kopier / ml), som var omtrent 40 ganger større enn FOR DEN enkeltrunde qrt-PCR-analysen. Sensitiviteten til denne analysen sammenligner seg gunstig med de tidligere rapporterte metodene ved bruk av sanntidsekvantering Med TaqMan-teknologi (Roche) og ET ABI Prism 7700 sekvensdeteksjonssystem (Perkin-Elmer), som har rapportert sensitiviteter på 10 kopier/reaksjon (9, 16) og 1,000 kopier/reaksjon (12). Følsomheten Til LightCycler (Roche) og SYBR Green i-deteksjon er også rapportert å være 10 kopier/reaksjon (10). For ytterligere å validere denne versjonen av analysen ble virusbelastningen på 16 HCV-positive serumprøver, som varierte fra 1 × 103 til 1.2 × 106 kopier / ml (som bestemt Med Amplicor Monitor assay), ble vist å korrelere tett med resultater oppnådd med den nestede sanntids qrt-PCR-analysen (R= 0,876, P < 0,0001, n = 16) (Fig. (Fig.11).

HCV replikerer i leveren, men få studier har forsøkt å relatere virusbelastninger i leveren til kliniske resultater, og foretrekker å undersøke den prediktive verdien av serumvirusbelastninger. Sistnevnte kan betraktes som en egnet surrogat for levervirus hvis de ble vist å korrelere, men få studier har vist dette, og resultatene rapportert til dags dato er ikke overbevisende. Den nestede qrt-PCR-analysen med begrenset syklus ble derfor brukt til å måle hepatisk HCV-belastning. Mengden levervev som ble brukt til analyse veide mellom 0,8 og 8,1 mg (gjennomsnitt = 3.88 ± 2.1 mg), hvorav 2.1 til 12.9 µ (gjennomsnitt = 6.62 ± 3.1 µ) AV RNA ble ekstrahert. Utbyttet av totalt RNA var i gjennomsnitt 1.71 × 103 hryvnias/g levervev, en verdi som lignet den som ble funnet i en tidligere studie på 1.01 × 103 hryvnias AV RNA/g (13). Nedsatt viral laster varierte fra 3.0 × 102 1,3 × 106 HCV-RNA-molekyler/µg total RNA, og gjennomsnittet var 2.38 × 105 ± 3.55 × 105 kopier/µg av RNA. Det er påvist en korrelasjon mellom levervirusmengde målt i ANTALL HCV-kopier per mikrogram av totalt RNA, og serumvirusmengde målt med Amplicor Monitor assay, selv om den var svak (r = 0,417, n = 20) (13). Andre studier har vist AT HCV RNA-belastningen i serum reflekteres vesentlig av mengden virus i leveren uten å gi korrelasjonskoeffisienter (3, 8). Her rapporterer vi for første gang en statistisk signifikant korrelasjon mellom lever-og serumvirusmålinger (r = 0,689, P = 0.004, n = 15), noe som indikerer at nivået av viremi faktisk reflekterer mengden virus tilstede i leveren (Fig. (Fig.22).

i tidligere studier har levervirusmålinger blitt uttrykt som antall kopier per milligram levervev eller antall kopier per mikrogram av totalt RNA. I denne studien viser vi at begge enhetene ser ut til å være egnet, da det var en signifikant korrelasjon mellom virusmengder målt i antall kopier per milligram levervev og de som ble målt som antall kopier per mikrogram av totalt RNA (R = 0,937, P < 0,0001, n = 20) (Fig. (Fig.3).3). Disse resultatene er i samsvar Med De Av De Moliner et al. (3), who viste også en nær korrelasjon mellom virusmengden i leveren, uttrykt som antall kopier per gram vev, og antall kopier per mikrogram av totalt cellulært RNA (r = 0,85) (3). Gjennomsnittlig antall av HCV-RNA-molekyler per gram av leveren vev var 2,1 × 108 ± 3.71 × 108, rundt 170 ganger høyere enn RNA-nivå i serum (1.22 × 106 ± 2.0 × 106 kopier/ml). Dette funnet er lik Som Terrault et al. (18), who viste at FORHOLDET MELLOM HCV RNA i leveren og det i serum var 103:1. I motsetning, McGuiness et al. (13) fant at nivået i levervev var større med en faktor på > 104. Denne forskjellen kan forholde seg til det faktum at nedsatt viral massevis av pasientene i den tidligere studien, som hovedsakelig hadde avansert HCV-infeksjon, var rundt åttedelte høyere (1.83 × 106 ± 0.75 × 106 kopier/µg av RNA) enn de som er tatt opp i denne studien (2.38 × 105 ± 3.55 × 105 kopier/µg av RNA).

SOM konklusjon er qrt-PCR-analysen i SANNTID en sensitiv, nøyaktig og pålitelig metode for overvåking AV HCV-belastninger i både serum-og leverprøver.