A conceptual and practical overview of cDNA microarray technology: implications for basic and clinical sciences

Braz J Med Biol Res, October 2005, Volume 38(10) 1543-1552 (Review)

a conceptual and practical overview of cDNA microarray technology: implications for basic and clinical sciences

V. de Mello-Coelho i K. L. Hess

Departamento de Histologia e Embriologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brasil

Streszczenie
tekst

korespondencja i Przypisy

Streszczenie

cDNA microarray to innowacyjna technologia, która ułatwia analizę ekspresji tysięcy genów jednocześnie. Wykorzystanie tej metodologii, która szybko się rozwija, wymaga połączenia wiedzy z nauk biologicznych, matematycznych i statystycznych. W tym przeglądzie staramy się przedstawić przegląd zasad technologii mikromacierzy cDNA, praktyczne obawy dotyczące analitycznego przetwarzania uzyskanych danych, korelację tej metodologii z innymi metodami analizy danych, takimi jak immunohistochemia w mikromacierzach tkankowych i zastosowanie mikromacierzy cDNA w różnych obszarach nauk podstawowych i klinicznych.

słowa kluczowe: Biotechnologia, mikromacierze cDNA, ekspresja genów, genomika

wprowadzenie

geny są jednostkami dziedzicznymi utworzonymi przez sekwencje kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA) zorganizowane w chromosomy w jądrze komórkowym. Skomplikowany proces transkrypcji z tych sekwencji skutkuje wytwarzaniem przekaźnikowych kwasów rybonukleinowych (mRNA). Te mRNA kodują białka, które składają się z aminokwasów i pełnią wyznaczoną funkcję genu (1). Tak więc cechy strukturalne i funkcjonalne komórek i tkanek są określane przez jednoczesną, selektywną i zróżnicowaną ekspresję tysięcy genów.

od ostatniej dekady badania obejmujące mapowanie genów, klonowanie i sekwencjonowanie dostarczyły istotnych informacji dla analizy strukturalnej odrębnych genomów (2,3). Ilość informacji uzyskanych z tych badań wymaga organizacji pozyskanych danych. Aby zaspokoić tę potrzebę, utworzono publiczne bazy danych, które przechowują miliony sekwencji genów i znaczników sekwencji wyrażonych (est), umożliwiając dołączenie do sekwencji genów w celu analizy podobieństw, jak również różnic między genomami różnych gatunków (4).

badania strukturalne genomów wywołały wiele pytań związanych z funkcjonalnym i regulacyjnym zrozumieniem profili ekspresji genów w różnych typach komórek i tkankach różnych organizmów (3,5,6). Technologia mikromacierzy DNA została opracowana w celu zbadania złożonego przetwarzania biologicznego obejmującego kilka tysięcy genów (7,8). Jedna z takich technologii mikromacierzy wykorzystuje pojedyncze nici DNA lub sondy (oligomery), które są nadrukowane na szklanej powierzchni za pomocą fotolitografii (9). Inną metodologią mikromacierzy DNA, która jest przedmiotem niniejszego przeglądu, jest technologia mikromacierzy komplementarnych DNA (cDNA) (10). Dzięki tym metodom możliwe jest 1) jednoczesne porównywanie dynamicznego wzorca ekspresji tysięcy genów w komórkach lub tkankach, 2) wykrywanie różnic molekularnych podczas różnych etapów procesów komórkowych, np. różnicowania, proliferacji i indukcji apoptozy, 3) identyfikowanie różnic transkrypcyjnych między Stanami niezakażonymi i patologicznymi, 4) identyfikowanie zmian w komórkach z powodu odpowiedzi na lek oraz 5) identyfikowanie nowych biomarkerów do potencjalnego zastosowania w diagnostyce, rokowaniu i klinicznej terapii chorób.

zasady technologii mikromacierzy cDNA

klasyczna metodologia stosowana do wykrywania i kwantyfikacji mRNA w danej komórce nazywa się analizą Northern blot (11). Główną zasadą analizy Northern blot jest hybrydyzacja znakowanej radioizotopem sondy genu specyficznego do mRNA związanego z filtrem, w celu określenia, czy ten gen jest obecny. Inną metodą stosowaną do wykrywania ekspresji określonego genu jest odwrotna transkrypcyjna reakcja łańcuchowa polimerazy (RT-PCR). RT-PCR obejmuje zastosowanie genowych starterów i odwrotnej transkryptazy do syntezy sekwencji cDNA do mRNA. CDNA jest następnie amplifikowany przez wiele rund transkrypcji z udziałem polimerazy tego szablonu cDNA (12). Istnieje kilka rodzajów RT-PCR, a najbardziej precyzyjnym pod względem ilościowym jest metoda RT-PCR w czasie rzeczywistym, która wymaga zautomatyzowanego systemu zdolnego do wykrywania fluorescencji indukowanej podczas reakcji RT-PCR (12). Podczas RT-PCR ekspresję określonego genu można wydedukować porównując go do genów konstytutywnie wyrażonych, znanych również jako geny” housekeeping”.

technologia mikromacierzy cDNA, która analizuje poziom ekspresji genów tysięcy genów jednocześnie, opiera się na tych samych zasadach, co w przypadku analiz Northern blot i RT-PCR (7,8). Zasadniczo, mikromacierz cDNA jest hybrydyzacją tysięcy genów z cDNA do odpowiadających im celów na chipie lub filtrze. Jednak obecne wyzwanie tej technologii polega na analizie znacznych ilości surowych danych liczbowych uzyskanych poprzez pozyskanie sygnałów hybrydyzacji (13). Analizy obliczeniowe i biostatystyczne są niezbędne do dokładnego przetwarzania istotnych danych dla konkretnych celów badania(Rysunek 1).

produkowanie cDNA microarray matryca

ostatnio, kilka firmy projektować cDNA microarrays koncentrować się na specyficzny gene expression profile systems. Matryce te są dostępne komercyjnie przez firmy biotechnologiczne, w tym SuperArray Bioscience Corporation i Affymetrix, do użytku w przystępnych cenach. W tej sekcji staramy się opisać podstawowe etapy produkcji matrycy mikromacierzowej cDNA.

pierwszym krokiem do wytworzenia matrycy mikromacierzowej cDNA jest selekcja i amplifikacja całkowitych lub częściowych fragmentów sekwencji cDNA, które mają być drukowane na substratach, które następnie będą hybrydyzowane z docelowymi sekwencjami cDNA (14,15). Najczęstsze metody wyboru sekwencji opierają się na następujących zasobach: 1) banki danych genów, takie jak Unigene, dbEST i GenBank, które dostarczają informacji o funkcji konkretnego genu i lokalizacji chromosomów; 2) Kolekcje klonów lub dostępne sekwencje cDNA na stronach internetowych przedsiębiorstw komercyjnych; 3) niestandardowe konstrukcje bibliotek cDNA z docelowej komórki lub materiału tkankowego wcześniej sklonowanego i zsekwencjonowanego w celu identyfikacji EST. Po wybraniu fragmenty cDNA są wzmacniane przez PCR na mikropłytkach multiwell, oczyszczane przez wytrącanie chemiczne, a następnie badane pod kątem jakości i ilości za pomocą elektroforezy żelowej. Produkty PCR są drukowane na suwaku lub membranie za pomocą zrobotyzowanej maszyny, mikromacierzy. Podczas zrobotyzowanego drukowania lub osadzania DNA, rurki kapilarne otrzymują stałe ciśnienie i sukcesywnie osadzają DNA na szkiełku lub membranie, tworząc w ten sposób „mikromacierz” (16). Różne rodzaje substratów, w tym szkiełka szklane i membrany nylonowe są wstępnie poddawane obróbce w celu zwiększenia ich ładunków hydrofobowych, co powoduje wzrost całkowitej przyczepności sekwencji DNA do substratów (13). Co najważniejsze, indeksowanie danych zawierające lokalizację tysięcy klonów cDNA wydrukowanych na podłożach odbywa się przez ostrożne etykietowanie każdej mikropłytki za pomocą oprogramowania zaprojektowanego do analizy bazy danych. Ta baza danych zawiera również tożsamość klona (Clone ID), nazwę genu, lokalizację chromosomu i funkcję(y) genu.

hybrydyzacja sondy cDNA z docelową matrycą mikromacierzy DNA

kluczowym czynnikiem dla pomyślnej hybrydyzacji sondy cDNA z docelową matrycą mikromacierzy DNA jest jakość mRNA z komórek lub tkanek. Zanieczyszczenia sondy RNA genomowym DNA, białkami lub pozostałościami detergentu mogą skutkować fałszywie dodatnimi / fałszywie ujemnymi danymi.

oznaczanie sondy podczas syntezy cDNA przez odwrotną transkrypcję sekwencji RNA zależy od rodzaju używanej mikromacierzy cDNA (16). Ogólnie rzecz biorąc, gdy analiza mikromacierzy cDNA jest przeprowadzana przy użyciu membran nylonowych jako substratu, sonda RNA jest znakowana radioaktywnie przez włączenie nukleotydów dctp-P33 podczas procesu odwrotnej transkrypcji (7). W przypadku mikromacierzy cDNA drukowanej na szkiełkach szklanych stosuje się nukleotydy promieniotwórcze (17) i barwniki fluorescencyjne o wysokiej skuteczności włączania, takie jak cyjanki Cy-3 dUTP i Cy-5 dUTP (8). Więcej informacji na temat typów mikromacierzy cDNA i procesu hybrydyzacji (7,8,17-20), patrz Tabela 1.

narzędzia analityczne do identyfikacji wzorców ekspresji genów z wykorzystaniem technologii mikromacierzy cDNA

narzędzia do analizy ogromnych ilości danych generowanych z mikromacierzy cDNA są nadal opracowywane. Obecnie badacze analizują dane z mikromacierzy cDNA przy użyciu różnych programów (21-24). Oznacza to, że nie ma jednej metody analizy ogromnej ilości danych uzyskanych za pomocą tej technologii. Wykorzystanie narzędzi biostatystycznych staje się coraz ważniejsze w analizie znaczenia profili ekspresji genów.

aby przedstawić ogólny pogląd na temat niektórych typów metod stosowanych do analizy danych mikromacierzy cDNA, opiszemy i omówimy kroki, które mogłyby utrudnić proces analizy. Niezwykle ważne jest Walidacja wyników poprzez ukończenie wielu eksperymentów replikacyjnych. Po pozyskaniu sygnałów hybrydyzacji substraty są badane wizualnie za pomocą programów obliczeniowych. W tym przypadku bierze się pod uwagę jakość substratów. Na przykład rozmyte obrazy punktowe, wytrąca się barwnik lub próbki z silnymi sygnałami tła są zwykle odrzucane. Analiza ta jest ważna w celu wyeliminowania artefaktów, które mogą prowadzić do wykrycia fałszywie dodatnich sygnałów (16). Różni badacze stosują metodę odejmowania tła sygnałów hybrydyzacji do niespecyficznych sygnałów w tle. W tym kroku, w zależności od użytego oprogramowania, możliwe jest odejmowanie sygnałów tła na następujące dwa sposoby: 1) przez średnią arytmetyczną lub medianę wynikającą z intensywności sygnału między dodatnimi sygnałami plam w substracie, lub 2) przez średnią arytmetyczną lub medianę niespecyficznego sygnału, takiego jak intensywność sygnału wynikająca z bezpośredniego obszaru wokół każdego punktu odpowiadającego konkretnemu sygnałowi genu. Za pomocą tych dwóch metod średnia arytmetyczna lub mediana wartości są odejmowane od sygnału dodatniego reprezentującego gen o różnej ekspresji (16). Akwizycja dodatniego natężenia sygnału w siatkach lokalizacji utworzonych za pomocą określonego oprogramowania jest zakończona w dowolnych wartościach znanych jako algorytmy. Wartości te można uzyskać bezpośrednio w oprogramowaniu bazy danych, które zawiera wcześniej skatalogowane informacje o każdym Genie wydrukowanym na podłożu.

ze względu na ogromną ilość jednocześnie analizowanych genów i zmienność we wszystkich etapach technicznych techniki mikromacierzy cDNA, ważne jest stworzenie czynnika regulacji lub kompensacji, który odbywa się poprzez proces normalizacji danych. Istnienie niespecyficznych sygnałów na substratach, problemy związane z ilością lub jakością RNA przed hybrydyzacją lub zmienność inkorporacji RNA przez sondę mogą doprowadzić do upośledzenia normalizacji próbki (14,16). W celu dalszej znaczącej interpretacji danych, proces normalizacji przeprowadza analizę porównawczą średniej arytmetycznej algorytmów z jednej grupy z inną, często wybieraną jako kontrola (24,25). Istnieje kilka rodzajów metod normalizacji i wybór najbardziej odpowiedniej metody może być wyzwaniem. Powodem tego jest to, że wiele zmiennych eksperymentalnych często uniemożliwiają dokładną identyfikację genów różniących się ekspresją bez fałszywie dodatnich/fałszywie ujemnych wyników zanieczyszczających ocenę danych. Wsparcie matematyczne, statystyczne i bioinformatyczne ma kluczowe znaczenie na tym etapie w technologii mikromacierzy cDNA.

metody normalizacji obejmują: 1) logarytmiczny stosunek zmierzonych poziomów ekspresji między różnymi grupami w oparciu o średnią, medianę, różnice medialne lub wariancję uzyskane ze wszystkich pozytywnych sygnałów znajdujących się na substratach; 2) Analiza regresji, która jest oceniana za pomocą współczynnika korelacji lub odległości euklidesowej i opiera się na rozkładzie reprezentowanym przez algorytmy odpowiadające intensywności sygnału w różnych próbkach tej samej grupy, oraz 3) testy statystyczne, takie jak t-test lub analiza asocjacyjna, które uwzględniają wielokrotne porównania sparowane w oparciu o znaczący próg P < 0,05 i korektę istotności progowej t-test, odpowiednio (25,26). Ponadto, lokalnie ważona metoda normalizacji regresji liniowej (lowess), często stosowana w tablicach fluorescencyjnych, odpowiada za zmniejszające się różnice sygnałów hybrydyzacji intensywności i przestrzenne położenie zauważonego cDNA na szkiełku (27).

po normalizacji najprostszą metodą identyfikacji różnic między wzorcami ekspresji genów jest użycie różnicy proporcji między próbką a jej odpowiednią kontrolą. W tym przypadku ustala się arbitralny limit i z tej wartości można wybrać geny różniąco wyrażone za pomocą oprogramowania bazodanowego. Na przykład możliwe jest ustalenie 2-krotnego progu identyfikacji genów o znaczących zmianach poziomu ekspresji. Podczas tego procesu geny w tym zakresie zostaną wybrane i uporządkowane w tabelach znajdujących się w bazie danych. Geny spełniające kryteria wyboru mogą być wizualizowane z baz danych za pomocą oprogramowania, które pokazuje samoorganizujące się Mapy (28,29). Ponadto te zmiany w profilach ekspresji genów między różnymi grupami mogą być wizualizowane w dendrogramach na podstawie hierarchicznej analizy klastrów (25,29,30). W tym przypadku geny, które są regulowane w dół są ogólnie pokazane na zielono i geny regulowane w górę są ogólnie pokazane na Czerwono. Ponieważ różnica regulacji genów jest bardziej intensywna, podobnie jak jej odpowiedni kolor. Programy do analizy danych mikromacierzy cDNA są dostępne przez Internet.

ważne jest, aby zauważyć, że analiza profili ekspresji genów nabytych przez technologię mikromacierzy cDNA obejmuje tysiące genów analizowanych jednocześnie. Przed wykonaniem badań fizjologicznych wybranych genów wyniki mikromacierzy cDNA należy potwierdzić na poziomie RNA za pomocą analizy Northern blot lub RT-PCR w czasie rzeczywistym (14). Eliminuje to możliwość fałszywie dodatnich wyników mikromacierzy cDNA z powodu krzyżowej hybrydyzacji między genami w obrębie tej samej rodziny genów. Dalsze potwierdzenie jest również wysoce zalecane na poziomie białka, na przykład poprzez analizę Western blot, cytometrię przepływową lub immunohistochemię. W tym kontekście możliwe jest obecnie oszacowanie genów na poziomie białka przy użyciu testów mikromacierzy tkankowych (31-33). Tissue microarray assay to metoda, która pozwala na ocenę do tysiąca tkanek jednocześnie przy użyciu określonego markera. Zasadniczo małe biopsje rdzenia o grubości 1 mm lub mniejszej są izolowane z pojedynczych bloków tkanek osadzonych parafiną za pomocą specjalnego metalowego urządzenia lub igły i umieszczane w innym bloku parafinowym w sposób szykowny. Zaletami tej techniki są: 1) oszczędność i zachowanie oryginalnych próbek tkanek uzyskanych do biopsji w celu skonstruowania tablicy; 2) aby uniknąć problemów technicznych, ponieważ tablica jest skonstruowana w pojedynczym szkiełku, ułatwiając w ten sposób procesy techniczne mycia i barwienia, oraz 3) szybkość wykonywania analizy in situ jednocześnie w kilku próbkach tkanek jednocześnie. Klinicznie jest to potężna technika łączenia z analizą mikromacierzy cDNA w celu identyfikacji nowych biomarkerów do potencjalnego zastosowania jako narzędzia diagnostyczne, prognostyczne i terapeutyczne przeciwko warunkom patologicznym (31,32).

technologia mikromacierzy cDNA: zastosowania i perspektywy

jeśli chodzi o zastosowanie, technologia mikromacierzy cDNA prowadzi do identyfikacji określonych genów i pozwala badaczom porównać profile ekspresji genów w warunkach normalnych i patologicznych w różnych organizmach. W podstawowej nauce, cDNA microarray używa utożsamiać rola kilka geny zaangażowany w komórkowi procesy, tak jak komórkowy różnicowanie, porównywać geny wyrażenie wzory między normalnymi i transfekującymi komórkowymi kulturami, na przykład (34). Wiele grup badawczych wykorzystało technologię mikromacierzy cDNA do badania różnych typów nowotworów, a także patogenezy chorób zakaźnych (35-40). W tym przypadku identyfikacja nowych genów lub zmiany wzorców ekspresji genów w tkankach od stanu nie chorego do chorego przyczyniły się do lepszego zrozumienia mechanizmów molekularnych regulujących początek i postęp chorób. Dodatkowo, cDNA microarray został uznany za bardzo interesującą metodologię w przemyśle farmaceutycznym. W tym kontekście analiza profilu ekspresji genów w dużej skali komórek poddanych różnym testom lekowym może mieć znaczenie dla klasyfikacji potencjalnych czynników do zastosowania terapeutycznego (41). Kilka przykładów zastosowania metodologii mikromacierzy cDNA w naukach podstawowych i klinicznych (34-48) opisano w tabeli 2.

analiza mikromacierzy cDNA jest kosztowną metodologią, ale obfitość wyników uzyskanych dzięki tej technologii jest niewątpliwą korzyścią. Gdy centralna jednostka badawcza jest zorganizowana w celu opracowania tej metodologii, różni badacze mogą korzystać z zalet używania wcześniej drukowanych substratów cDNA do badania genów różniących się ekspresją zarówno w obszarach biologicznych, jak i klinicznych. Dla organizacja cDNA microarray jednostki, multidyscyplinarny interakcja między matematyczny i biologiczny Arena musi rozważać. Prosty hipotetyczny model schematyczny pokazujący infrastrukturę jednostki mikromacierzy cDNA przedstawiono na rysunku 2.

wreszcie stworzono scentralizowane banki zawierające dane profili ekspresji genów analizowanych za pomocą technologii mikromacierzy cDNA, które są dostępne do wglądu przez Internet (49,50). W ten sposób różne grupy na całym świecie będą w stanie porównać dane wybranych profili genów z innymi zdeponowanymi w molekularnych bankach danych, takich jak Gene Expression Omnibus lub Array Express, zaprojektowany przez Europejski Instytut Bioinformatyki (51).

problemem, który ograniczył korzystną interakcję między różnymi grupami badawczymi wykorzystującymi technologię mikromacierzy cDNA, jest brak standardów prezentacji i wymiany wyników. Aby skompensować tę sytuację, stworzono minimalną informację dla adnotacji eksperymentu Mikromacierzowego (MIAME) (52). Wytyczne prowadzące do standaryzacji eksperymentów mikromacierzy cDNA zostały zaproponowane przez Micro-array gene Expression data Society (MGED). MIAME składa się zasadniczo z sześciu sekcji: 1) projekt eksperymentalny; 2) Projekt tablicy; 3) wykorzystane próbki, preparaty ekstraktu i hybrydyzacja; 4) procedury i parametry hybrydyzacji; 5) Obraz, kwantyfikacja i pomiar parametrów oraz 6) typy, wartości i specyfikacje dla kontroli normalizacji. MIAME stało się wymogiem publikowania wyników mikromacierzy cDNA w wielu czasopismach naukowych. Dodatkowo różne grupy, w tym MGED, Rosetta, Agilent i Affymetrix, współpracowały przy użyciu bioinformatyki, aby zaprojektować ekspresję genów mikromacierzy (MAGE), która jest wspólną elastyczną platformą strukturalną, która umożliwia komunikację między różnymi grupami badawczymi przy użyciu technologii mikromacierzy cDNA. MAGE składa się z następujących elementów: 1) MAGE – on (object model), centrycznego modelu danych, który wykorzystuje Ujednolicony język modelowania i implementuje wymagania MIAME; 2) MAGE-ML (język znaczników), który dokumentuje tłumaczenie z MAGE-OM na format danych oparty na XML, oraz 3) MAGE-SLK, swobodnie dostępne oprogramowanie, które definiuje interfejs programistów aplikacji do MAGE-om, umożliwiając w ten sposób eksport danych do MAGE-ML, a następnie przechowywanie danych w relacyjnej bazie danych (53).

ostatnio nanotechnologia została szeroko wdrożona w różnych dziedzinach, takich jak Zastosowania przemysłowe, farmaceutyczne i rządowe, w celu poprawy nowoczesnego postępu naukowego. Ze względu na unikalne właściwości fizyczne i chemiczne nanocząstek, materiały te mają zdolność do wzmocnienia urządzeń sensorycznych, dodatków napędowych, technik przebudowy tkanek i mechanizmów celowania leków. Ponadto nanotechnologia została wykorzystana w celu poprawy biegłości w mikromacierzy (54) i pomocy w rozwoju nanoarrays białek (55). W warunkach laboratoryjnych naukowcy zaczynają obecnie badać potencjalny pozytywny / negatywny wpływ nanocząstek na indukcję / hamowanie genów w komórkach za pomocą techniki mikromacierzy (56). Wreszcie, połączenie nanotechnologii z technologią mikromacierzy zwiększyło nawet aktualną wiedzę na temat genów regulowanych w różny sposób podczas procesów chorobowych (57,58).

razem te narzędzia mogą przyczynić się do zrozumienia nowych funkcji genów w różnych genomach i ich korelacji z patogenezą choroby u ludzi. Rozwój i zastosowanie technologii mikromacierzy cDNA przyniosły duży postęp w odkrywaniu leków, diagnostyce badawczej i potencjalnej terapii genowej przeznaczonej do leczenia różnych chorób. Ta podstawowa technologia pomaga naukowcom w zrozumieniu mechanizmów molekularnych zaangażowanych w wiele i różnorodne procesy biologiczne.

9. Sengupta R & Tompa M (2002). Kontrola jakości w produkcji tablic oligo: kombinatoryczne podejście projektowe. Journal of Computational Biology, 9: 1-22.

11. Alwine JC, Kemp DJ & Stark GR (1977). Sposób wykrywania specyficznych RNA w żelach agarozowych przez przeniesienie do papieru diazobenzyloksymetylowego i hybrydyzację z sondami DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 74: 5350-5354.

12. Bustin A (2000). Bezwzględne oznaczanie mRNA przy użyciu testów reakcji łańcuchowej polimerazy odwrotnej transkrypcji w czasie rzeczywistym. Journal of Molecular Endocrinology, 25: 169-193.

17. Whitney LW & Becker KG (2001). Radioaktywne sondy 33-P w hybrydyzacji do szklanych mikromacierzy cDNA przy użyciu tkanek nerwowych. Journal of Neuroscience Methods, 106: 9-13.

19. Shalon D, Smith SJ & Brown PO (1996). System mikromacierzy DNA do analizy złożonych próbek DNA za pomocą hybrydyzacji dwukolorowej sondy fluorescencyjnej. Genome Research, 6: 639-645.

20. Bertucci F, Bernard K, Loriod B et al. (1999). Zagadnienia wrażliwości w pomiarach ekspresji opartych na tablicy DNA i wydajności nylonowych mikromacierzy dla małych próbek. Human Molecular Genetics, 8: 1715-1722.

22. Kerr MK & Churchill GA (2001). Bootstrapping cluster analysis: assessing the reliability of conclusions from microarray experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 98: 8961-8965.

23. Planet PJ, Desalle R, Sidall m et al. (2001). Systematyczna analiza danych mikromacierzy DNA: porządkowanie i interpretowanie wzorców ekspresji genów. Genome Research, 11: 1149-1155.

24. Tanaka TS, Jaradat SA, Lim MK et al. (2000). Profilowanie ekspresji genomu łożyska i zarodka w połowie ciąży przy użyciu 15 000 mysich mikromacierzy cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 97: 9127-9132.

25. Quackenbush J (2001). Analiza obliczeniowa danych mikromacierzy. Nature Genetics, 2: 418-427.

27. Yang YH, Dudoit S, Luu P et al. (2002). Normalizacja danych mikromacierzy cDNA: solidna metoda kompozytowa adresująca pojedyncze i wielokrotne przesunięcia systematyczne. Badania nad kwasami nukleinowymi, 30: e15.

28. Tamayo P, Slonim D, Mesirov J et al. (1999). Interpretacja wzorców ekspresji genów z samoorganizującymi się mapami: metody i zastosowanie do różnicowania krwiotwórczego. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 96: 2907-2912.

30. Eisen MB, Spellman PT, Brown PO et al. (1998). Analiza klastrów i wyświetlanie wzorców ekspresji całego genomu. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 95: 14863-14868.

31. Braunschweig T, Chung JY & Hewitt SM (2004). Perspectives in tissue microarrays. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening, 7: 575-585.

34. Tseng YH, Butte AJ, Kokkotou E et al. (2005). Przewidywanie różnicowania preadipocytów przez ekspresję genów ujawnia rolę substratów receptora insulinowego i necdinu. Nature Cell Biology, 7: 601-611.

36. Staudt LM (2001). Fizjologia ekspresji genów i patofizjologia układu odpornościowego. Trendy w immunologii, 22: 35-40.

37. Berns A (2000). Ekspresja genów w diagnostyce. Nature, 403: 491-492.

38. Sawiris GP, Sherman-Baust CA, Becker KG et al. (2002). Opracowanie wysoce wyspecjalizowanej tablicy cDNA do badania i diagnostyki nabłonkowego raka jajnika. Cancer Research, 62: 2923-2928.

39. Khan J, Wei JS, Ringner m et al. (2001). Klasyfikacja i PREDYKCJA diagnostyczna nowotworów z wykorzystaniem profilowania ekspresji genów i sztucznych sieci neuronowych. Nature Medicine, 7: 673-679.

40. Chang JC, Hilsenbeck SG & Fuqua SA (2005). Genomic podejścia w zarządzaniu i leczeniu raka piersi. British Journal of Cancer, 92: 618-624.

41. Lovett RA (2000). Toksykogenomika. Toksykolodzy szykują się na rewolucję genomiczną. Science, 289: 536-537.

42. Flores-Morales a, Stahlberg N, Tollet-Egnell P et al. (2001). Analiza mikromacierzy in vivo wpływu hypofizektomii i leczenia hormonem wzrostu na ekspresję genów u szczurów. Endocrinology, 142: 3163-3176.

43. Liu K, Li Y, Prabhu V et al. (2001). Augmentacja w ekspresji indukowanych aktywacją genów odróżnia pamięć od naiwnych limfocytów T CD4+ i jest molekularnym mechanizmem zwiększonej odpowiedzi komórkowej limfocytów T CD4+. Journal of Immunology, 166: 7335-7344.

44. Hess K, Yang y, Golech s et al. (2004). Kinetyczna ocena ogólnych zmian ekspresji genów podczas ludzkiej naiwnej aktywacji limfocytów T CD4+. International Immunology, 16: 1711-1721.

46. Hacia JG, Fan JB, Ryder O et al. (1999). Oznaczanie alleli przodków dla ludzkich polimorfizmów jednonukleotydowych przy użyciu matryc oligonukleotydowych o wysokiej gęstości. Nature Genetics, 22: 164-167.

49. Miles M (2001). Microarray: utracone w burzy danych? Nature Neuroscience, 2: 441-443.

50. Becker KG (2001). Udostępnianie danych mikromacierzy cDNA. Nature Neuroscience, 2: 438-440.

54. Wang X, Jiang N, Feng X i in. (2003). Nowatorskie podejście do wysokiej jakości przetwarzania mikromacierzy przy użyciu technologii wizualizacji trzeciej matrycy barwnika. IEEE Transactions on Nanobioscience, 2: 193-201.

56. Berry CC, Charles S, Wells s et al. (2004). Wpływ przenoszenia stabilizowanych nanocząstek magnetycznych na ludzkie fibroblasty skórne w hodowli. International Journal of Pharmaceutics, 269: 211-225.

57. Crnic I & Christofori G (2004). Nowe technologie i najnowsze postępy w badaniach nad przerzutami. International Journal of Developmental Biology, 48: 573-581.

korespondencja i Przypisy