zależność między okresem po wazektomii a zdolnością rozrodczą nasienia uzyskanego w wyniku aspiracji najądrza

Streszczenie

tło: nie jest dobrze określone, czy upływ czasu po wazektomii ma jakikolwiek wpływ na wynik IVF–ICSI przy użyciu nasienia najądrza. Analizowaliśmy retrospektywnie wyniki 151 cykli ICSI, w których w różnych okresach po wazektomii stosowano plemniki mężczyzn poddanych wazektomii. Metody: oocyty uzyskano po odczulającym protokole stymulacji jajników przy użyciu agonisty GnRH w połączeniu z rekombinowanym FSH i HCG. Plemniki pobierano przezskórnym pobraniem nasienia najądrza. Cykle podzielono na trzy grupy: ≤10 lat po wazektomii (Grupa 1, n = 47), 11-19 lat po wazektomii (Grupa 2, N = 79) i ≥20 lat po wazektomii (Grupa 3, N = 25). Wyniki: Jak można się było spodziewać, średni wiek mężczyzn różnił się w trzech grupach (Grupa 3 > Grupa 2 > Grupa 1), a średni wiek kobiet był również znacznie wyższy w grupie 3 niż w grupach 1 i 2, chociaż nie opisano różnic między grupami 2 i 3. Wszystkie pozostałe parametry laboratoryjne i kliniczne były podobne w tych trzech grupach. Trwająca ciąża i częstość implantacji (odpowiednio 34, 25, 8% i 22, 15, 6%) zmniejszyły się znacząco z grupy 1 do grupy 3. Wniosek: Wskaźniki ciąży i implantacji po ICSI z plemnikami z wazektomizowanych mężczyzn są negatywnie skorelowane z przedziałem czasu od wazektomii, co nie może być wyjaśnione wyłącznie przez starzenie się mężczyzn lub kobiet.

wprowadzenie

ICSI to skuteczna technika leczenia wspomaganego rozrodu, która została opracowana pierwotnie w celu złagodzenia niepłodności męskiej (Palermo et al., 1992; Van Steirteghem et al., 1993). Wyniki uzyskane z wytrysku spermy wydają się nie być związane ze stężeniem plemników lub morfologii (Nagy et al., 1995a; Svalander et al., 1996). Rokowanie jest zagrożone tylko w tych przypadkach, w których nie znaleziono ruchliwych plemników (Nagy et al., 1995a).

aspiracja plemników najądrza i jądra jest rutynowo stosowana w celu uzyskania plemników w przypadkach obturacyjnej i nie obturacyjnej azoospermii. Wskaźniki zapłodnienia są w tych przypadkach podobne do tych uzyskanych z plemników z ejakulatu (Nagy et al., 1995b; Van Steirteghem et al., 1998). ICSI, w związku z tym, stał się skuteczną alternatywą dla przywrócenia płodności w przypadkach po wazektomii, w których reanastomoza nie powiodła się lub czas od wazektomii spowodowało wtórne miejsca najądrza niedrożności. Ponadto ICSI może wyeliminować negatywny wpływ na płodność przeciwciał przeciwko plemnikom często obecnych u tych mężczyzn (Heidenreich et al., 1994). W większości przypadków obturacyjnych, w tym po wazektomii mężczyzn, najądrza plemników aspiracji jest metodą wyboru w celu uzyskania nasienia (Craft et al., 1995). Aspiracja cienkoigłowa, jako technika, jest prostszą i mniej inwazyjną procedurą niż interwencja mikrochirurgiczna na najądrzach lub jądrach (Tournaye et al., 1998).

ostatnie doniesienia sugerują, że płodność mężczyzn zmniejsza się wraz z wiekiem (Auroux, 1993). Jednak wcześniej opublikowano, że u normalnych zdrowych mężczyzn jakość nasienia jako takiego nie spada znacząco z czasem(Fisch et al., 1996). Ponadto, ICSI wynik wydaje się nie być związane z wiekiem ojcowskim (Spandorfer et al., 1998).

z drugiej strony, związany z czasem negatywny wpływ na jakość nasienia i płodność został opisany u mężczyzn po wazektomii (Urry et al., 1990). Odnotowano większą częstość występowania przeciwciał anty-plemnikowych i zlepiania się plemników wraz ze zmniejszeniem odsetka ruchliwych plemników (Weiske, 2001).

ze względu na powyższe korzyści ICSI nad reanastomoza, znaczny odsetek obturacyjnych azoospermicznych pacjentów poszukujących leczenia ICSI są mężczyzn wazektomizowane. Ponieważ obecnie nie wiadomo, czy okres po wazektomii ma jakikolwiek wpływ na wynik ICSI–IVF, przeanalizowaliśmy związek między okresem po wazektomii a zdolnością rozrodczą plemników po ICSI.

materiały i metody

poddaliśmy retrospektywnej analizie wyniki 151 cykli ICSI, wykonanych z powodu obturacyjnej azoospermii po wazektomii, zakończonych w okresie od czerwca 1998 do czerwca 2000 roku. Pacjentów przydzielono do trzech grup w zależności od okresu po wazektomii. Odstęp od wazektomii został zaokrąglony do najbliższego ukończonego roku od daty wazektomii do czasu ICSI. Wszystkie przypadki były kierowane do naszego Centrum, ponieważ wybrali ICSI zamiast reanastomozy vas jako podstawową formę terapii. Wszystkie przypadki zostały poddane przezskórnej aspiracji plemników najądrza (Pesa) jako technice uzyskiwania nasienia. Grupa 1 składała się z 47 cykli, w których okres od wazektomii wynosił ≤10 lat; Grupa 2 obejmowała 79 cykli, w których okres od wazektomii wynosił od 11 do 19 lat, a grupa 3 obejmowała 25 cykli, w których okres od wazektomii wynosił ≥20 lat.

stymulację jajników przeprowadzono stosując kombinację agonisty GnRH (octan leuprolidu, Lupron®; Abbott Laboratórios do Brasil Ltda, São Paulo, Brazylia), długiego protokołu i rekombinowanego FSH (Gonal-F®; Serono Laboratorios, São Paulo, Brazylia). Rozwój pęcherzyków był monitorowany za pomocą okresowych pomiarów stężenia estradiolu w surowicy i ultrasonografii pochwy. HCG 10 000 IU (Profasi®; Serono Laboratorios) podawano, gdy co najmniej dwa pęcherzyki osiągnęły średnią średnicę 18 mm, a pobranie oocytów przeprowadzono metodą ultradźwiękową przezpochwową aspiracją 34 godziny później.

pobranie nasienia z najądrza

Igłę o rozmiarze 27,5 wprowadzono do proksymalnej części najądrza (zwykle znajdującej się w górnym biegunie jądra) i przeprowadzono delikatne ssanie strzykawką o pojemności 1 ml (B-D; Becton Dickinson Ind. Cirúrgicas Ltda, Kurytyba, Brazylia). Aspirat umieszczono w szalce Petriego i przepłukano medium IVF-50 (IVF Science Scandinavian, Göteborg, Szwecja). Próbkę oceniono na obecność plemników ruchliwych. Jeśli w próbce nie było ruchliwego nasienia, aspiracja najądrza była powtarzana.

procedury Laboratorium Embriologicznego

oocyty zebrane w czystym płynie pęcherzykowym natychmiast wysłano do sąsiedniego laboratorium embriologicznego, gdzie zidentyfikowano je za pomocą mikroskopu rozbiorowego w powiększeniu ×50. Po zidentyfikowaniu oocyty umieszczano w jednym naczyniu do hodowli studni (3260; Costar, Cambridge, MA, USA) z 1,0 ml 80 IU/ml hialuronidazy (Hyase-1; IVF Science Scandinavian) przez 30 s, a następnie zostały przemyte kilka razy w pożywce IVF-50. Każdy oocyt umieszczano oddzielnie w jednej kropli 30 µl medium IVF-50 i pokryto lekkim olejem mineralnym (Ovoil 150; IVF Science Scandinavian) i inkubowano przez 2-4 godziny w 37°C w atmosferze z 5% CO2. Pod koniec okresu inkubacji komórki cumulusa i corona radiata usunięto plastikową pipetą o średnicy 135 µm, połączoną ze striptizerem komórek (Mid Atlantic Diagnostics Inc., Medford, NJ, USA).

dojrzałość jądrową i jakość ooplazmatyczną oceniano za pomocą mikroskopu odwróconego światła (Nikon Diaphot Microscope®; Nikon Corporation, Tokio, Japonia) przy powiększeniu ×200 lub ×400. Oocyty metafazy II (MII) poddano mikroiniekcji w ciągu 2-4 godzin od pobrania. Metafazę I (MI) oocytów obserwowano w celu wytłaczania pierwszego ciała polarnego w odstępach 4-godzinnych do 8-godzinnych po pobraniu i odpowiednio przeprowadzono wstrzyknięcie. Metody wstrzykiwania nasienia były wcześniej zgłaszane(Abdelmassih et al., 1996).

po wstrzyknięciu nasienia oocyty inkubowano w 1 ml pożywki IVF-50, pokrytej olejem mineralnym, przez 16-18 godzin. oocyty obserwowano 16-18 godzin po ICSI pod kątem obecności lub braku pronuclei i ciał polarnych (Nagy i wsp., 1998a). Zapłodnienie uznano za normalne, gdy obecne były dwa wyraźnie odrębne pronukleie. W przypadku zaobserwowania pojedynczego wymowy, drugą ocenę przeprowadzono około 4 godziny później. Po wykryciu obecności trzech pronuklei oocyt został odrzucony.

oocyty zawierające dwa przedjądra hodowano oddzielnie w kroplach 30 µl pożywki IVF-50 pokrytej olejem mineralnym w szalce Petriego (3260; Costar) i trzymano do momentu przeniesienia. Zarodki obserwowano po 42 h (dzień 2) i po 68 h (dzień 3) po wstrzyknięciu i klasyfikowano zgodnie z kryteriami zaproponowanymi przez Staessen (Staessen et al., 1989). W zależności od liczby blastomerów i względnego udziału fragmentów bezjądrowych obecnych w zona pellucida zarodki klasyfikowano do jednej z czterech kategorii: 1, doskonały (Typ A), gdy brak fragmentu bezjądrowego (Stadium 6 – do 8-komórkowe w dniu 3); 2, Dobry (Typ B), gdy <20% zarodka było fragmentowane (Stadium 6 – do 8-komórkowe w dniu 3 lub <6 komórek bez fragmentacji); 3, sprawiedliwy (Typ C), gdy względna ilość fragmentów wynosiła od 20 do 50%; oraz 4, słaby (typ D), gdy >50% zarodka było fragmentowane. Zarodki o rozdrobnieniu >50% nie były przenoszone.

w momencie transferu zarodki załadowano do 15 µl pożywki IVF-50 przy użyciu cewnika Edwardsa Wallace ’ a o długości 23 cm (Simcare Manufacturing Ltd, Hythe, Kent, UK).

faza lutealna była wspierana przez codzienne podawanie 800 mg progesteronu dopochwowego (Utrogestan®; Laboratoires Beins-Isvovesco, Paryż, Francja) i transdermic 100 µg plastrów estradiolu zmienianych codziennie (Estraderm TTS100®; Biogalênica Laboratório, São Paulo, Brazylia). Stężenia β-HCG w surowicy oznaczano 12 dni po przeniesieniu zarodka.

USG przezpochwowe wykonano u wszystkich pacjentów z rosnącymi mianami β-HCG; oceniono obecność i liczbę wewnątrzmacicznych worków ciążowych, a także obecność bieguna płodu i aktywność serca. Ciąża była monitorowana przez położnika pacjenta, a ostateczny wynik został zgłoszony do kliniki zarówno przez położnika, jak i pacjentkę.

Analiza statystyczna

jednokierunkowa analiza wariancji (ANOVA) i testy Kruskala–Wallisa zostały wykorzystane do porównania wieku kobiet i mężczyzn, szybkości zapłodnienia, jakości zarodka, liczby przeniesionych zarodków i okresu po wazektomii. Do porównania częstości ciąży, implantacji i aborcji wykorzystano analizę tabeli awaryjnej oraz dokładne testy Fishera.

wyniki

Najważniejsze wyniki 151 cykli objętych badaniem przedstawiono w tabeli I. Średnia wieku mężczyzn wzrosła z grupy 1 do 3, a różnica między każdą grupą była statystycznie istotna (P < 0, 0001). Średni wiek kobiet był znacząco niższy w grupie 1 w porównaniu z grupami 2 i 3, ale nie różnił się w grupie 2 w porównaniu z grupą 3 (Tabela I).

średnia liczba pobranych i wstrzykniętych komórek jajowych oraz wskaźniki zapłodnienia były podobne we wszystkich trzech grupach. Jakość zarodków i liczba przeniesionych zarodków były również podobne w trzech grupach (Tabela I).

kliniczny wskaźnik ciąży i trwający wskaźnik ciąży korelowały znacząco z okresem wazektomii (P < 0, 05; χ2 test trendu), a dłuższy okres wazektomii wiązał się z mniejszą liczbą ciąż (Tabela I). Częstość implantacji również zmniejszyła się z grupy 1 do 3, a różnica między wszystkimi grupami była statystycznie istotna (P < 0,05, analiza tabeli awaryjnej i dokładny test Fishera). Odsetek aborcji wykazywał tendencję do wzrostu z grupy 1 do 3, ale nie osiągnął istotności statystycznej wśród grup.

aby wykluczyć wpływ wieku kobiet na wyniki, przeanalizowaliśmy dane z 84 ze 151 cykli, w których uwzględniono tylko kobiety w wieku ≤35 lat. Wyniki, zorganizowane w ten sam sposób w trzech grupach, przedstawiono w Tabeli II. różnica w średnim wieku mężczyzn w trzech grupach pozostała znacząca (P < 0, 0001) , ale wiek kobiet nie różnił się znacząco między tymi trzema grupami. Podobna była również liczba wstrzykniętych i zapłodnionych oocytów w tych trzech grupach, a także liczba i jakość zarodków przekazywanych chorym. Trwająca ciąża i częstość implantacji były istotnie wyższe w grupach 1 i 2 w porównaniu z grupą 3(Tabela II).

dyskusja

nasze dane potwierdzają, że przezskórne pobranie nasienia z najądrza w połączeniu z ICSI jest skuteczną opcją leczenia w celu złagodzenia niepłodności po wazektomii. Technika pobierania nasienia jest prosta, wykonywana w znieczuleniu miejscowym i może być powtarzana bez wyraźnego uszkodzenia najądrza.

co ważne, wyniki naszych badań sugerują, po raz pierwszy, negatywną korelację między wynikiem ciąży wspomaganego zapłodnienia a okresem od wazektomii do leczenia. Różnica w częstości ciąży i implantacji utrzymywała się po skorygowaniu wyników w odniesieniu do wieku kobiet. Jedyne widoczne różnice kliniczne pozostały to średni wiek mężczyzn pomiędzy grupami i okres wazektomii. Wpływ wieku mężczyzny na wyniki wspomaganego rozrodu nie jest dobrze określony. Niektóre badania sugerują spadek potencjału płodności z postępującym wiekiem mężczyzn (Auroux, 1993), jednak większość badań nie wykazała korelacji między starzeniem się a potencjałem reprodukcyjnym mężczyzn (Krause and Habermann, 2000). Również indywidualne badania kontrolne przez okres do 25 lat nie wykazały żadnych istotnych zmian(Fisch et al., 1996). Co ważniejsze w odniesieniu do naszego badania, wyniki ICSI dla różnych kategorii diagnostycznych nie mają wpływu na wiek partnera męskiego (Spandorfer et al., 1998) w przeciwieństwie do ważnej roli wieku partnerki (Abdelmassih et al., 1996; Devroey i in., 1996).

wskaźnik sukcesu odwrócenia wazektomii w przywracaniu płodności jest odwrotną relacją z czasem od wazektomii (Belker et al., 1991). Do tej pory, związane z czasem negatywne skutki wazektomii w odniesieniu do płodności przypisywano czynnikom mechanicznym (rosnąca częstość występowania wtórnych miejsc niedrożności najądrza), które utrudniały odbudowę anatomiczną, oraz pojawieniu się znaczących mian przeciwciał przeciwko plemnikom (Heidenreich et al., 1996). ICSI oczywiście pokonuje blokadę mechaniczną, a wyniki uzyskane techniką są niezależne od czynników immunologicznych (Nagy et al., 1995c).

wszystkie przypadki objęte badaniem poddano aspiracji nasienia najądrza. Silber i in. sugerują, że w przypadkach przewlekle zablokowanych najądrzy, plemniki cierpią zmiany związane z starzeniem się ze znacznym zmniejszeniem ruchliwości w kierunku dystalnej części (Silber et al., 1995). Z drugiej strony Moore poinformował, że w tych przypadkach nieproporcjonalna liczba martwych lub umierających plemników znajduje się również w części proksymalnej (Moore, 1998). Autor sugeruje, że w normalnych warunkach płyn najądrza chroni żywotne plemniki przed enzymami akrosomalnymi uwalnianymi przez plemniki w procesie degeneracji. Stagnacja wtórna do przewlekłej niedrożności zakłóciłaby ten mechanizm ochronny. Ponadto wykazano, że u mężczyzn z obturacyjną azoospermią DNA plemników jąder jest znacznie mniej uszkodzone niż proksymalne DNA plemników najądrza (Steele et al., 1999). W tym samym badaniu autorzy stwierdzili, że jakość DNA w nasieniu uzyskanym z jądra jest taka sama jak u normalnych mężczyzn, co sugeruje, że uszkodzenie Znalezione w nasieniu najądrza jest nabywane z czasem po wyprodukowaniu. Kuszące jest spekulowanie, że uszkodzenie DNA plemników najądrza zwiększa się wraz z czasem niedrożności, a w przedstawionych tu przypadkach-z czasem po wazektomii. W tej samej linii myślenia, stosowanie immotyle (z powodu necrozoospermia) wytrysku lub najądrza plemników do ICSI było związane z bardzo słabym zapłodnieniem i rozwojem embrionalnym; jednak plemniki jąder (od tego samego pacjenta), nawet jeśli nieruchome, zapewniły znacznie lepszy wynik cyklu leczenia (Nagy et al., 1995a; Tournaye et al., 1996; Nagy et al., 1998b).

w badaniu tym nie stwierdzono istotnych różnic w szybkości zapłodnienia i jakości zarodków przenoszonych w 72 h po zapłodnieniu pomiędzy trzema grupami. Wpływ wykorzystania uszkodzonych molekularnie plemników na zapłodnienie można maskować za pomocą ICSI, a wczesne etapy rozwoju zarodka zależą głównie od informacji matki, ponieważ Genom embrionalny jest aktywowany po Stadium 8-komórkowym (Braude et al., 1988). Jednak zwiększone uszkodzenie DNA plemników najądrza (stosowane wyłącznie w zgłaszanych przypadkach) może stanowić wyjaśnienie dla niższego wskaźnika implantacji zarodka i wyższego wskaźnika poronień stwierdzanego w przypadkach, w których okres po wazektomii był dłuższy.

nasze wyniki różnią się od danych zgłoszonych przez innych (Sukcharoen et al., 2000), ale nie może być w bezpośredniej sprzeczności. Liczba przypadków uwzględnionych w naszym badaniu była znacznie większa, a wcześniej zgłaszane dane obejmowały niektóre przypadki, w których ICSI wykonano z plemników uzyskanych z jąder.

przedstawione tu wyniki mogą mieć istotne implikacje kliniczne. Przezskórna aspiracja nasienia najądrza jest prostą, szybką i popularną procedurą pozyskiwania nasienia od mężczyzn z obturacyjną azoospermią; jednakże, w świetle niniejszego badania, aspiracja cienkoigłowa z jąder może stanowić lepsze podejście, zwłaszcza w przypadkach o dłuższym czasie niedrożności. Należy jednak przeprowadzić dalsze gromadzenie i analizę danych uzyskanych z badań prospektywnych w celu ustalenia najlepszej interwencji w tych przypadkach.