Braz J Med Biol Res, maj 2004, objętość 37(5) 625-634
zastosowanie odwrotnej transkrypcji-PCR w diagnostyce przewlekłej choroby ziarniniakowej związanej z X
P. Agudelo-Flórez1, J. A. López1, J. Redher1, M. M. S. Carneiro-Sampaio2, B. T. Costa-Carvalho3, A. S. Grumach4 i A. Condino-Neto1
1Centro Badań w Pediatrii i oddziałów Pediatrii i Farmakologii, Wydział Nauk Medycznych, Uniwersytet Stanowy w Campinas, Campinas, SP Brazylia
2Departamento Immunologii, Instytut Nauk Biomedycznych, Uniwersytet Sao Paulo, Sao Paulo, SP, Brazylia
3Disciplina Alergii, Immunologii i Reumatologii, oddział Pediatrii, Szkoła Paulista Medycyny, Uniwersytet Federalny w San Paulo, Sao Paulo, SP, Brazylia
4Laboratório Badania Medyczne 56, Dział Dermatologia, Wydział lekarski, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil
Streszczenie
wprowadzenie pacjenci i metody
wyniki
dyskusja podziękowania korespondencja i Przypisy
Streszczenie 
przewlekła choroba ziarniniakowa (CGD) jest dziedzicznym zaburzeniem wrodzonego układu odpornościowego charakteryzującym się wadliwym oksydacyjnym pęknięciem fagocytów i późniejszym upośledzeniem ich aktywności bakteriobójczej. Mutacje w jednym ze składników oksydazy NADPH wpływają na ekspresję genu lub funkcję tego układu, prowadząc do fenotypu CGD. Defekty w gp91-phox prowadzą do X-linked CGD, odpowiedzialnego za około 70% przypadków CGD. Badanie wysoce heterogenicznego genotypu pacjentów z CGD obejmuje analizę mutacji, testy Northern blot lub Western blot w zależności od konkretnego przypadku. Celem niniejszego badania było wykorzystanie odwrotnej transkrypcji (RT)-PCR do analizy defektów molekularnych odpowiedzialnych za X-linked CGD u ośmiu Brazylijskich pacjentów i ocena jego możliwości szerszego zastosowania do badań przesiewowych molekularnych w CGD. Całkowity RNA przygotowano z limfocytów B transformowanych wirusem Epsteina B i poddano odwrotnej transkrypcji przy użyciu losowych heksamerów. Otrzymaną cDNA Amplifikowano PCR za pomocą specyficznych i nakładających się par starterów zaprojektowanych do amplifikacji trzech regionów genu gp91-phox: eksonów 1-5, 3-9 i 7-13. Strategia ta wykryła wadliwą ekspresję gp91-phox u siedmiu pacjentów. Wyniki RT-PCR były zgodne z historią kliniczną, danymi biochemicznymi (test nitroblue tetrazolium lub test uwalniania ponadtlenku) i dostępną analizą mutacji w czterech przypadkach. W trzech dodatkowych przypadkach wyniki RT-PCR pasowały do historii klinicznej i danych biochemicznych. W innym przypadku RT-PCR była prawidłowa, pomimo historii klinicznej zgodnej z CGD i wadliwego pęknięcia układu oddechowego. Wnioskujemy, że to nowe zastosowanie analizy RT-PCR-prostej, ekonomicznej i szybkiej metody-było odpowiednie do przesiewania defektów molekularnych u 7 z 8 pacjentów z CGD połączonych X.
słowa kluczowe: Ponadtlenek, fagocyty, pierwotny niedobór odporności, wybuch oddechowy, neutrofile, człowiek
wprowadzenie
przewlekła choroba ziarniniakowa (CGD) to pierwotny niedobór odporności pierwotnie opisany w 1957 roku jako jednostka kliniczna dotykająca niemowlęta męskie i nazwany, w tym czasie, śmiertelną chorobą ziarniniakową dzieciństwa. Głównymi cechami CGD są nawracające i ciężkie infekcje obejmujące naturalne bariery organizmu, takie jak drogi oddechowe i węzły chłonne, a ostatecznie struktury wewnętrzne, takie jak wątroba, śledziona, kości i mózg (1-3). Szacowana częstość występowania tej rzadkiej choroby wynosi 1/250 000 żywych urodzeń rocznie. Infekcje są na ogół wywoływane przez bakterie katalazo-ujemne, takie jak Staphylococcus aureus, pałeczki Gram-ujemne oraz gatunki grzybów, takie jak Aspergillus, Candida i Nocardia (4,5).
układ NADPH-oksydazy wytwarza ponadtlenek i inne reaktywne półprodukty tlenu, kluczowe dla mikrobiobójczej aktywności fagocytów. Wada biochemiczna w CGD polega na upośledzeniu aktywności oksydazy NADPH i późniejszej niezdolności do niszczenia mikroorganizmów (6). Głównymi składnikami układu NADPH-oksydazy są gp91-, P22-, p47-, p67-i P40-phox. Defekty molekularne powodujące CGD są na ogół spowodowane brakiem, niską ekspresją lub nieprawidłowym działaniem jednego ze składników oksydazy NADPH. Postać X-linked tej choroby jest spowodowana defektami gp91-phox, ciężkiego łańcucha cytochromu b588 i stanowi około 70% wszystkich przypadków (7,8). Formy autosomalne recesywne są spowodowane wadami jednego ze składników cytozolowych oksydazy NADPH (p47 – lub P67-phox, odpowiednio w 20 i 5% przypadków) lub składnika łańcucha lekkiego cytochromu b588 (p22-phox, 5% przypadków) (9,10). CGD jest wysoce heterogenicznym stanem: ponad 300 mutacji zostało zarejestrowanych w międzynarodowej bazie danych X-CGD (8). Mutacje zostały rozmieszczone głównie w obrębie 13 eksonów lub w granicach eksonu / intronu genu gp91-phox (CYBB)i prawie 200 z tych mutacji jest unikalnych.
rozpoznanie CGD opiera się na ogólnej charakterystyce klinicznej choroby wraz z wadliwą aktywnością oksydazy NADPH, co wykazano w nieprawidłowym badaniu nitroblue tetrazolium (NBT), dihydrorhodamine 123 lub testach uwalniania ponadtlenku (11,12). W stymulowanym teście NBT normalne osoby wykazują prawie 100% komórek dodatnich, podczas gdy u pacjentów z CGD mniej niż 5% komórek jest dodatnich (13). Ponadto komórki pacjentów z wariantem CGD są dodatnie, ale wykazują jedynie bardzo niską aktywność (6). Test NBT wykrywa również nośniki X-linked CGD (matki i siostry). Definitywna diagnostyka molekularna CGD jest ustalana u pacjentów z nieprawidłowym testem NBT lub aktywnością rozerwania oddechowego, którzy mają jedną z następujących cech: mutację w gp91-, p22-, p47-lub P67-phox; brak mRNA dla jednego z tych genów wykryty przez Analizę Northern blot; i/lub brak białka dla jednego z tych składników oksydazy przez Western blot. Diagnostykę genetyczną, ale nie molekularną, można ustalić poprzez wykazanie kuzynów, wujków lub siostrzeńców matek z nieprawidłowym testem NBT lub pęknięciem oddechowym (14). Tak więc ustanowienie ostatecznej diagnozy tej rzadkiej i wysoce heterogenicznej choroby wymaga złożonych i kosztownych metod, takich jak kombinacja Northern blot lub Western blot i jednoniciowa analiza polimorfizmu konformacyjnego (SSCP), a następnie sekwencjonowanie DNA kilku członków rodziny, wszystkie wykonywane w laboratoriach badawczych o wysokiej złożoności.
metoda odwrotnej transkrypcji-PCR (RT-PCR) polega na amplifikacji cDNA przez PCR. Technika ta może być łatwo standaryzowana w mniej wyrafinowanych laboratoriach. Dostarcza informacji na temat ekspresji genów i wstępnych danych na temat struktury lub wielkości mRNA wadliwego składnika. RT-PCR rzadko był stosowany w badaniach CGD, ograniczając się do badań patofizjologicznych (15-29). Do tej pory potencjalne wykorzystanie tego użytecznego narzędzia do ustalenia ostatecznej diagnozy CGD związanego z X, najczęściej występującej postaci, nie było szeroko badane. Celem niniejszego badania była ocena zastosowania RT-PCR do przesiewowych defektów molekularnych odpowiedzialnych za X-linked CGD, rzadki i prawdopodobnie błędnie zdiagnozowany niedobór odporności, u ośmiu Brazylijskich pacjentów.
pacjenci i metody
pacjenci
w badaniu wzięło udział 8 niepowiązanych mężczyzn z Brazylii z prawdopodobnym CGD związanym z X (2 czarnych i 6 białych; wiek 2-8 lat; wzrost 88-108 cm; masa ciała 11-19 kg). Pacjenci przedstawili historię kliniczną nawracających ciężkich zakażeń, takich jak zapalenie płuc, zapalenie węzłów chłonnych, ropień wątroby, zapalenie skóry i działania niepożądane szczepienia BCG. Zostali skierowani do naszego laboratorium do diagnostyki biochemicznej i molekularnej. Przed rozpoczęciem badania uczestnicy uzyskali pisemną świadomą zgodę. Komisja Etyki Szkoły Medycznej zatwierdziła Protokół zgodnie z Konwencją Helsińską i brazylijskim Ministerstwem Zdrowia, Rezolucja 196/96.
biochemiczna diagnoza CGD
biochemiczna diagnoza CGD została ustalona zgodnie z Pan American Group for Immunodeficiences criteria. Zaburzenie aktywności oksydazy NADPH wykazano w teście ślizgowym NBT i (lub) teście uwalniania anionów ponadtlenkowych przez neutrofile krwi obwodowej i leukocyty jednojądrzaste (14,30,31). Neutrofile i leukocyty jednojądrzaste uzyskano przez odwirowanie próbek krwi na gradiencie gęstości Ficoll-Hypaque (32).
test ślizgowy NBT opierał się na redukcji NBT do formazanu przez aktywowane leukocyty (31). Badanie przeprowadzono zgodnie z wcześniej opisanym opisem (30). Ponad 95% z 200 prawidłowych neutrofili stymulowanych 30 nM 12-mirystynianem 13-octanu (PMA) forbolu powinno być w stanie zmniejszyć NBT. Uznano, że brak reakcji lub <5% komórek dodatnich wskazuje na diagnozę CGD (14).
ilościowe uwalnianie ponadtlenków przez neutrofile i leukocyty jednojądrzaste oceniano za pomocą zmodyfikowanego testu redukcji cytochromu c hamującego dysmutazę ponadtlenkową (33-35). Ilość uwalnianego ponadtlenku obliczono stosując współczynnik ekstynkcji wynoszący 0,21 nM / cm dla cytochromu C. wyniki podaje się jako nadtlenek nmolu uwalniany przez 106 komórek na godzinę. Pacjenci z CGD wykazywali mniej niż 10% wartości kontrolnych.
przesiewowe defekty molekularne odpowiedzialne za X-linked CGD
limfocyty B od pacjentów z X-linked CGD przekształcono in vitro z wirusem Epsteina B (EBV) (15,16) w celu zapewnienia obfitego źródła kwasów nukleinowych do badań molekularnych. Transformowane przez EBV linie komórek B odtwarzają biochemiczne i molekularne defekty pacjentów z CGD (15,16,36) i eliminują potrzebę wielokrotnego pobierania krwi. Krótko mówiąc, leukocyty krwi obwodowej pacjentów z CGD związanym z X hodowano supernatantami z B95-8, linii komórkowej producenta EBV (15,16,36,37), w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej inaktywowaną Cieplnie płodową surowicą bydlęcą (10%), 2 mM L-glutaminą, 100 J/ml penicyliny i 100 µg/ml streptomycyny, w 37ºC, w wilgotnej atmosferze z 5% CO2. Żywotność komórek była monitorowana i kultury utrzymywały się przez cały okres badania.
próbki RNA z linii komórek B przekształconych EBV przygotowano metodą HCL guanidyny, następnie wytrącono etanol i oznaczono ilościowo metodami standardowymi (38,39). Próbki cDNA otrzymano przez odwrotną transkrypcję 2 µg całkowitego RNA za pomocą SuperScript II RT (GIBCO BRL) i losowych heksamerów (15). Jakość próbek mRNA sprawdzano przez amplifikację PCR ß-aktyny, konstytutywnej kontroli genów (bp 920-943 i bp 1494-1471) (Gen Bank accession No. NM001101).
ekspresję genu gp91-phox oceniono metodą RT-PCR. Specyficzne i nakładające się pary podkładów (Gen Bank nr NM_000397, Tabela 1) wykorzystano do amplifikacji (30 cykli) trzech regionów egzonicznych gp91-phox: 1-5, 3-9 i 7-13. Ta strategia pozwoliła nam na sprawdzenie wszystkich eksonów gp91-phox. Produkty PCR analizowano za pomocą 2% elektroforezy w żelu agarozowym i barwiono bromkiem etydyny.
względną ekspresję genu gp91-phox analizowano za pomocą oprogramowania Image Master (Pharmacia-Biotech). Wynik densytometrii dla próbek docelowych podzielono przez wynik densytometrii ß-aktyny, konstytutywnej kontroli genów, normalizującej poziom rozważany do analizy. Wyniki testów RT-PCR porównano z wywiadem klinicznym pacjenta, testami biochemicznymi (NBT i (lub) testem uwalniania ponadtlenku) oraz dostępnymi danymi z analizy mutacji (http://www.sbi.org.br/Sbi2003/ indeks.htm).
wyniki
badaliśmy 8 mężczyzn z historią kliniczną nawracających ciężkich zakażeń, skierowanych do naszego laboratorium do biochemicznej i molekularnej diagnostyki CGD. Wyniki badań ślizgowych NBT i testów uwalniania ponadtlenku przedstawiono w tabeli 2. Sześciu pacjentów wykazało mniej niż 5% dodatnich leukocytów w teście ślizgowym NBT. U sześciu pacjentów stwierdzono upośledzenie uwalniania ponadtlenku przez granulocyty i (lub) leukocyty jednojądrzaste (mniej niż 10% w porównaniu do zdrowych grup kontrolnych). U czterech pacjentów wyniki obu badań były nieprawidłowe. Wszyscy pacjenci przedstawili co najmniej jeden nieprawidłowy test i otrzymali diagnozę prawdopodobnego CGD związanego z chromosomem X. Matka i siostra pacjenta T. B. P. zaprezentowały test ślizgowy NBT zgodny ze statusem nośnika X-linked CGD. W okresie badania jeden pacjent (G. M.) zmarł na zapalenie płuc.
następnie zbadaliśmy ostateczną diagnozę X-linked CGD poprzez analizę RT-PCR ekspresji genu gp91-phox. Wyniki amplifikacji RT-PCR z trzema zestawami nakładających się starterów przedstawiono w tabeli 2. Jakość próbki mRNA sprawdzano przez amplifikację PCR ß-aktyny, konstytutywnej kontroli genów. W tym przypadku uzyskano oczekiwane produkty normalne (Rys. 1, 2 i 3).
w czterech przypadkach możliwe było dopasowanie danych RT-PCR z dostępną analizą mutacji, przedstawioną w innym miejscu przez Patiño i wsp. (30) lub przez naszą grupę (//www.sbi.org.br/Sbi2003/index.htm): J. E. M. przedstawił Przejście C469®T w eksonie 5, przewidując mutację nonsensowną (R157X). M. F. przedstawił nonsensowną substytucję w eksonie 3, R (arginina) 73-Stop. R. S. wykazał podstawienie 264 G®A na 3′ złączu splicingu gp91-phox exon 3. Sekwencja cDNA wykazała delecję eksonu 3 gp91-phox, dając początek niestabilnemu lub niefunkcjonalnemu mutantowi gp91-phox. G. G. przedstawiono wadliwe splatanie eksonu gp91-phox 3 (podstawowa mutacja nie została jeszcze określona). Pozostali pacjenci nadal są badani.
jako całość strategia ta umożliwiła wykrycie wadliwej ekspresji gp91-phox u siedmiu z ośmiu pacjentów. Wyniki RT-PCR były zgodne z historią kliniczną, danymi biochemicznymi (NBT lub testem uwalniania ponadtlenku) i dostępną analizą mutacji w czterech przypadkach. W trzech dodatkowych przypadkach wyniki RT-PCR pasowały do historii klinicznej i danych biochemicznych. W innym przypadku RT-PCR był normalny, pomimo historii klinicznej zgodnej z CGD, wadliwego pęknięcia układu oddechowego charakteryzującego się testem NBT i testem uwalniania ponadtlenku oraz testami NBT jego matki i siostry zgodnymi ze statusem nośnika CGD związanego z X.
dyskusja
ten artykuł przedstawia badania biochemiczne i ekspresji genów 8 niepowiązanych Brazylijskich pacjentów płci męskiej z historią kliniczną CGD, którzy zostali skierowani do naszego laboratorium w celu szczegółowego zbadania. CGD jest rzadkim dziedzicznym zaburzeniem, w którym komórki fagocytarne nie są w stanie wytwarzać anionów ponadtlenkowych i innych reaktywnych półproduktów tlenu. Początkowo ustaliliśmy diagnozę prawdopodobnego X-linked CGD za pomocą metod biochemicznych, takich jak testy ślizgowe NBT i/lub testy uwalniania anionów ponadtlenkowych. Nasze wyniki wykazały, że wszyscy pacjenci wykazywali upośledzoną funkcję NADPH-oksydazy i, z kolei, prawdopodobne X-linked CGD.
obie metody przyczyniają się do prawdopodobnej diagnozy CGD na różne sposoby. Badanie NBT slide dostarcza informacji o liczbie komórek, które redukują NBT do formazanu wewnątrz cytoplazmy i intensywności tej redukcji. Tak więc, pacjenci z wariantowymi postaciami X-linked CGD wykazują nieprawidłowe testy ślizgowe NBT, w których większość komórek słabo redukuje NBT do formazanu. Test ślizgowy NBT wykrywa również żeńskie nosiciele X-linked CGD. Test uwalniania ponadtlenku mierzy redukcję cytochromu c przez ponadtlenek wytwarzany przez aktywowane leukocyty obecne w reakcji, umożliwiając rozpoznanie wariantowych form CGD związanych z X. Oba testy mogą być łatwo standaryzowane w laboratoriach o niskiej złożoności i nie wymagają drogiego sprzętu. Test dihydrorhodamine 123 jest bardzo czułą metodą diagnostyki biochemicznej CGD; wymaga jednak cytometru przepływowego, bardzo drogiego instrumentu.
oceniliśmy ekspresję genu gp91-phox w limfocytach B transformowanych EBV od pacjentów z CGD za pomocą analizy RT-PCR. Do amplifikacji trzech regionów genu gp91-phox przez RT-PCR użyto specyficznych i nakładających się par starterów: eksonów 1-5, 3-9 i 7-13. Strategia ta umożliwiła wykrycie wadliwej ekspresji gp91-phox u 7 z 8 pacjentów. Wyniki RT-PCR były zgodne z historią kliniczną, danymi biochemicznymi (NBT lub testem uwalniania ponadtlenku) i dostępną analizą mutacji w czterech przypadkach. W trzech dodatkowych przypadkach wyniki RT-PCR pasowały do historii klinicznej i danych biochemicznych.
ekspresja genu gp91-phox została zmniejszona we wszystkich egzonicznych regionach R. B. redukcja ta może być wynikiem mutacji prowadzących do niskiej stabilności RNA lub zmienionej aktywności transkrypcyjnej. Pacjenci G. M. I T. P. wykazano brak ekspresji eksonów 7-13, co sugeruje, że zmniejszona ekspresja tych dodatkowych eksonów 3′-końcowych może być wynikiem niestabilności RNA lub defektu splicingu, np. częściowo poprawnego splicingu w celu wytworzenia sygnału, ale częściowo nieprawidłowego splicingu w celu wyeliminowania miejsca wiązania startera, co zostanie zbadane przez przyszłe analizy mutacji genomowego DNA.
pacjent G. G. przedstawił rozproszony, mały obfitość, mniejszy produkt eksonów 1-5 (ryc. 1) i brak ekspresji innych regionów egzonicznych. Jego analiza mutacji wykazała defekt w miejscu splotu eksonu 3. Podobnie, analiza mutacji pacjenta R. S. ujawniła również defekt w miejscu splotu eksonu 3. Jednak w tym przypadku można wykryć mniej obfity produkt PCR.
Pacjent M. F. wykazywał zmniejszoną ekspresję regionów egzonicznych 3-9 i 7-13, co może być wynikiem nieprawidłowej aktywności transkrypcyjnej w eksonie 3. J. E. M. przedstawił mutację nonsensowną w eksonie 5, która doprowadziła do utraty ekspresji gp91-phox, o czym świadczy analiza RT-PCR, która jest prawdopodobną konsekwencją niestabilności mRNA wywołanej nonsensem.
w jednym przypadku pacjent T. P. B., ekspresja genu gp91-phox była normalna, pomimo historii rodzinnej zgodnej z CGD i wadliwej aktywności układu oddechowego. W tym przypadku rozpoznanie prawdopodobnego X-linked CGD opierało się na nieprawidłowych testach NBT u jego matki i siostry, zgodnych ze statusem nosiciela. Stawiamy hipotezę, że mutacja punktowa, taka jak podstawienie pojedynczej bazy, która nie zmienia długości ani obfitości fragmentu PCR, powinna być zbadana w tym konkretnym przypadku.
RT-PCR jest potężnym narzędziem do oceny ekspresji genów. Ta cecha może częściowo wyjaśnić zmienność ekspresji genu gp91-phox wśród pacjentów włączonych do tego badania oraz znaczenie łączenia nakładających się par starterów w celu prześwietlenia pełnej długości wiadomości. RT-PCR był stosowany w izolowanych badaniach przypadków jako część wstępnej diagnozy różnych form CGD (17-22). Analiza RT-PCR była również przydatna w diagnostyce prenatalnej CGD, wynikającej z niedoboru p47-phox (23). Jednak jest on powszechnie stosowany do badania regulacji genów składników oksydazy NADPH w różnych komórkach (15,16,24-29). Do tej pory potencjalne wykorzystanie tego użytecznego narzędzia do ustalenia ostatecznej diagnozy CGD związanego z X, najczęściej występującej postaci, nie zostało szeroko zbadane. Należy przeprowadzić dalsze badania w celu porównania czułości i swoistości tego testu w porównaniu z innymi złożonymi testami, takimi jak zachodnie lub Północne plamy.
ogólnie rzecz biorąc, wykazaliśmy, że RT-PCR, prosta i tania metodologia, ustanowiła ostateczną diagnozę X-linked CGD w 7 z 8 przypadków, bez konieczności stosowania złożonych i kosztownych metodologii, takich jak Northern blot, slot blot, analiza SSCP lub sekwencjonowanie genomowego DNA. Tak więc RT-PCR może być odpowiednim narzędziem do diagnozowania CGD w laboratoriach w krajach rozwijających się. Bardzo ważne jest określenie ostatecznego molekularnego defektu genetycznego w celu zapewnienia odpowiedniego poradnictwa genetycznego i rokowania dla rodzin z CGD. Ponadto molekularne badania genetyczne ludzkiego układu NADPH-oksydazy posłużą do poszerzenia wiedzy na temat tego kluczowego i starożytnego mechanizmu obronnego.
2. Landing BH & Shirkey HS (1957). Zespół nawracających infekcji i nacieków trzewi przez pigmentowane histiocyty lipidowe. Pediatrics, 20: 431-442.
3. Patterson EL, Milstrey R & Stokstad ELR (1975). Wpływ selenu w zapobieganiu skazie wysiękowej u piskląt. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 95: 617-620.
5. Forrest CB, Forehand JR, Axtell RA, Roberts RL & Johnston Jr RB (1988). Cechy kliniczne i aktualne Postępowanie w przewlekłej chorobie ziarniniakowej. Hematology/Oncology Clinics of North America, 2: 253-266.
6. Curnutte JT (1993). Przewlekła choroba ziarniniakowa: rozwiązanie zagadki klinicznej na poziomie molekularnym. Immunologia kliniczna i Immunopatologia, 67: S2 – S15.
7. Dinauer MC, Orkin SH, Brown R, Jesaitis AJ & Parkos CA (1987). Glikoproteina kodowana przez X-linked przewlekłej choroby ziarniniakowej locus jest składnikiem kompleksu cytochromu B neutrofilów. Nature, 327: 717-720.
9. Clark RA, Malech HL, Gallin JI, Nunoi H, Volpp BD, Pearson DW, Nauseef WM & Curnutte JT (1989). Warianty genetyczne przewlekłej choroby ziarniniakowej: występowanie niedoborów dwóch składników cytozolowych układu oksydazy NADPH. New England Journal of Medicine, 321: 647-652.
10. Cross AR, Noack D, Rae J, Curnutte JT & Heyworth PG (2000). Mutacje ważne hematologicznie: autosomalne recesywne formy przewlekłej choroby ziarniniakowej (pierwsza aktualizacja). Blood Cells, Molecules and Diseases, 26: 561-565.
11. Smith RM & Curnutte JT (1991). Molekularne podstawy przewlekłej choroby ziarniniakowej. Blood, 77: 673-686.
12. Vowells SJ, Fleisher TA, Sekhsaria s, Alling DW, Maguire TE & Malech HL (1996). Zmienność zależna od genotypu w cytometrii przepływowej zmniejszonej czynności oksydazy fosforanowej dinukleotydu nikotynamidoadeninowego u pacjentów z przewlekłą chorobą ziarniniakową. Journal of Pediatrics, 128: 104-107.
15. Condino-Neto a & Newburger PE (1998). Aktywność oksydazy NADPH i zawartość cytochromu b558 w ludzkich limfocytach B transformowanych wirusem Epsteina-Barr korelują z ekspresją genów kodujących składniki układu oksydazowego. Archives of Biochemistry and Biophysics, 360: 158-164.
16. Condino-Neto a & Newburger PE (2000). Interferon-gamma poprawia skuteczność splicingu transkryptów genu CYBB w reagującym na interferon wariancie przewlekłej ziarniniakowej choroby związanej z X, spowodowanej mutacją w obszarze konsensusu miejsca splicingu. Blood, 95: 3548-3554.
19. Bonizzato a, Russo MP, Donini m & Dusi S (1997). Identyfikacja podwójnej mutacji (D160V-K161E) w genie p67phox u pacjenta z przewlekłą chorobą ziarniniakową. Biochemical and Biophysical Research Communications, 231: 861-863.
21. Noack D, Heyworth PG, Newburger PE & Cross AR (2001). Niezwykła mutacja introniczna w genie CYBB powodująca przewlekłą chorobę ziarniniakową. Biochimica et Biophysica Acta, 1537: 125-131.
22. Roesler J, Curnutte JT, Rae J, Barrett D, Patino P, Chanock SJ & Goerlach a (2000). Rekombinacja pomiędzy genem P47-phox i jego wysoce homologicznymi pseudogenami jest główną przyczyną autosomalnej recesywnej przewlekłej choroby ziarniniakowej. Blood, 95: 2150-2156.
23. De Boer M, Singh V, Dekker J, Di Rocco M, Goldblatt D & Roos D (2002). Diagnostyka prenatalna w dwóch rodzinach z autosomalnym, P47 (phox) – niedoborem przewlekłej choroby ziarniniakowej z powodu nowej mutacji punktowej w NCF1. Prenatal Diagnosis, 22: 235-240.
24. Baehner RL, Millar-Groff s & Bringas P (1999). Ekspresji rozwojowej składników oksydazy fagocytarnej NADPH u zarodków myszy. Pediatric Research, 46: 152-157.
25. Banerjee R, Anguita J, Roos D & Fikrig E (2000). Cutting edge: zakażenie przez czynnik ludzkiej granulocytic ehrlichiosis zapobiega pęknięciu układu oddechowego poprzez regulację w dół gp91phox. Journal of Immunology, 164: 3946-3949.
26. Bayraktutan U, Blayney L & Shah AM (2000). Charakterystyka molekularna i lokalizacja składników oksydazy nad (P) H gp91-phox i P22-phox w komórkach śródbłonka. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology, 20: 1903-1911.
27. Cobbs S, Malech HL, Leto TL, Freeman SM, Blaese RM, Gallin JI & Lomax KJ (1992). Retrowirusowa ekspresja rekombinowanego białka p47phox przez limfocyty B transformowane wirusem Epsteina-Barr od pacjenta z autosomalną przewlekłą chorobą ziarniniakową. Blood, 79: 1829-1835.
28. Gorlach a, Brandes RP, Nguyen K, Amidi M ,Dehghani F & Busse R (2000). Gp91phox zawierający oksydazę NADPH selektywnie wyrażoną w komórkach śródbłonka jest głównym źródłem generowania rodników tlenu w ścianie tętniczej. Circulation Research, 87: 26-32.
29. Rouzaut a, Lopez-Moratalla n & de Miguel C (2000). Różnicowa ekspresja genów w aktywacji i dojrzewaniu monocytów ludzkich. Archives of Biochemistry and Biophysics, 374: 153-160.
31. Ochs HD & Igo RP (1973). The NBT slide test: a simple screening method for detecting chronic ziarniniakowatość disease and female carriers. Journal of Pediatrics, 83: 77-82.
32. Boyum A (1968). Izolacja komórek jednojądrzastych i granulocytów z krwi ludzkiej. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation, 21 (Suppl 97): 1-77.
33. Condino-Neto a, Muscara mn, Grumach AS, Carneiro-Sampaio MMS & de Nucci G (1993). Neutrofile i komórki jednojądrzaste od pacjentów z przewlekłą chorobą ziarniniakową uwalniają tlenek azotu. British Journal of Clinical Pharmacology, 35: 485-490.
35. Condino-Neto a, Muscara MN, Grumach AS, Bellinati-Pires R, Brandao AC, Carneiro-Sampaio MMS & de Nucci G (1996). Wpływ rekombinowanej ludzkiej terapii interferonem-gamma na uwalnianie neutrofilów i komórek jednojądrzastych tlenku azotu u pacjentów z przewlekłą chorobą ziarniniakową. Journal of Interferon and Cytokine Research, 16: 357-364.
36. Volkman DJ, Buescher ES, Gallin JI & Fauci AS (1984). Linie komórek B jako modele dziedzicznych chorób fagocytarnych: wytwarzanie ponadtlenku w przewlekłej chorobie ziarniniakowej i granulki w zespole Chediaka-Higashiego. Journal of Immunology, 133: 3006-3009.
37. Nilsson K, Klein G, Henle W & Henle G (1971). Ustanowienie linii komórek limfoblastoidalnych z ludzkiej tkanki limfatycznej dorosłej i płodowej oraz jej zależność od EBV. International Journal of Cancer, 8: 443-450.
39. Subrahmanyam YVBK, Baskaran N, Newburger PE & Weissman SM (1999). A modified method for the display of 3 ’ – end restrictionary fragments of cDNA: Molecular profiling of gene expression in neutrophils. Methods in Enzymology, 303: 272-297.
podziękowania
autorzy dziękują pacjentom i ich rodzinom za udział i pomoc, a pielęgniarce Silvanie Severino za pomoc techniczną. Autorzy dziękują również Prof. Peterowi Newburger z University of Massachusetts Medical School za krytyczną recenzję tego manuskryptu.
korespondencja i Przypisy