ELISA: Como Analisar Resultados Experimentais

Pelo Dr. Surat P, Ph D. Revisto pelo Dr. Tomislav Meštrović, MD, Ph.d. D.

ELISA, ou Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) é uma ferramenta utilizada para detectar e quantificar substâncias, tais como peptídeos, proteínas, anticorpos e hormônios. Envolve a imobilização de um antigénio ou anticorpo numa superfície, seguida pela adição de uma amostra a analisar. A detecção depende de uma reacção específica antigénio-anticorpo.

Jarun Ontakrai |

o Que fazer antes da execução de um ELISA

Um teste de ELISA deve ser sempre realizada em replica (duplicatas ou triplicates), de modo a alcançar um número suficiente de amostras para calcular o desvio padrão e o coeficiente de variação. O coeficiente de erro deve ser mantido inferior a 20%. Se o erro calculado for elevado, devem ser avaliados os erros decorrentes da pipetagem, da contaminação das placas e reagentes, da evaporação e/ou da temperatura.

curva-padrão

é utilizada uma curva-padrão para medir a concentração da amostra. Em primeiro lugar, traçam-se os valores de absorvância das concentrações normalizadas (pg/ml). Também é feita uma curva negativa que não contém dados de amostra padrão e é usada para detectar e medir o ruído de fundo. Para uma medição precisa, este valor de fundo deve ser subtraído da curva-padrão.

os valores de absorvância da concentração conhecida podem ser traçados como um controlo positivo. A concentração da proteína-alvo obtém-se primeiro calculando a absorvância média e, em seguida, utilizando a curva-padrão para estimar a concentração.Devem também ser tidos em conta factores de diluição

. Por exemplo, se a amostra tiver sido diluída quatro vezes, a absorvância deve ser multiplicada por quatro Antes de se utilizar a curva-padrão para determinar a concentração.

Coeficiente de variação

A definição de coeficiente de variação é a razão entre o desvio padrão e a média – isto é, o desvio padrão (σ)/média (µ). Valores elevados de coeficiente de variação indicam imprecisões devidas à pipetagem ou mistura de reagentes entre Poços, contaminação bacteriana ou fúngica, secagem de poços ou variações de temperatura.

recuperação de picos

o valor obtido após a realização do teste ELISA depende da forma como uma proteína alvo interage com os anticorpos, e esta interacção é comparada a uma curva proteica padrão. Vários fatores-incluindo tampão, matriz e anticorpos heterofílicos-podem afetar a ligação da amostra, pelo que isso deve ser tido em conta ao determinar a exatidão de um ELISA.

pode ser efectuado um teste spike para determinar a exactidão dos resultados ELISA. Neste ensaio, é adicionada ou enriquecida na amostra uma quantidade conhecida de proteína recombinante. Em seguida, usando a curva padrão, a quantidade de material é medida. Grandes desvios nos valores medidos podem indicar erros devidos a elementos desconhecidos no ensaio.O ensaio de linearidade

O ensaio de linearidade

o ensaio de linearidade também é utilizado para determinar a exactidão de ELISA. Neste caso, a “amostra enriquecida” é diluída em série para 1:2, 1:4 e 1:8. Se for detectada a concentração da amostra alterada e se os resultados não apresentarem uma alteração linear nas medições, pode indicar erros na precisão do ELISA.

em alguns casos, podem observar-se erros em certas concentrações e já não se observam em concentrações mais baixas. Nesses casos, a amostra pode ter de ser diluída antes de se efectuarem as medições da concentração.

Resolução de problemas

plano de Fundo, o ruído pode ser causado por um número de fatores, incluindo:

• lavagem Insuficiente dos poços
• Contaminados lavagem de buffers
• muito reagente de detecção
• reactividade Cruzada do anticorpo
• Precipitação de buffer e/ou analito

às Vezes, pobres curva padrão pode ser gerado. Isto pode ser devido a erros na solução padrão, degradação do padrão, padrão é indevidamente reconstituído, ou se a curva não se encaixa na escala. Considerando este último, plotting pode ser feito usando escalas diferentes, como log-log ou curva logística de 5 parâmetros.

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Escrito por

Dr. Surat P

Dr. Surat graduou-se com um Ph. D. em Biologia Celular e Mecanobiologia do Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, Índia) em 2016. Antes de seu doutorado, Surat estudou para um Bacharel em Ciências (B.Sc.) Licenciatura em Zoologia, durante a qual foi beneficiária de uma bolsa de Verão da Academia Indiana de Ciências para estudar as proteínas envolvidas na Sida. Ela produz artigos sobre uma ampla gama de tópicos, como ética médica, manipulação de dados, pseudociência e superstição, educação e evolução humana. Ela é apaixonada pela comunicação científica e escreve artigos cobrindo todas as áreas das Ciências da vida.

Citações