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ARN do VHC.

o objectivo deste estudo foi desenvolver um ensaio simples de QRT-PCR em tempo real para a quantificação do ARN do VHC em amostras séricas e hepáticas com detecção SYBR Green I, em vez de utilizar sondas marcadas. Os ensaios QRT-PCR em tempo Real foram realizados com um LightCycler (Roche) com amplificação única e uma nova amplificação aninhada de ciclo limitado. Os padrões de RNA foram transcritos com polimerase T7 a partir de amplificadores derivados de 5′ produtos PCR de região não traduzida clonados em Pgem-T Easy (Promega) e tratados duas vezes com RQ1 DNase. O ARN foi quantificado por espectrofotometria. Para a quantificação simples das amostras de soro, o ARN foi transcrito ao contrário, como descrito anteriormente (7). Para a quantificação da PCR aninhada de ciclo limitado, foi realizada uma RT-PCR numa reacção de um passo com 15 ciclos de PCR (a etapa de ciclo limitado), seguida de uma QRT-PCR em tempo real. As cargas do VHC foram medidas por PCR em tempo real com os primários externos KY78 e KY80 para reacções de ciclo único (21) ou os primários externos mais os primários internos hep21b e hep22 para reacções aninhadas de ciclo limitado (19). As misturas de reacção incluíram 2 µl de ADN Mestre SYBR Green I (Roche) de arranque rápido, 4 mM MgCl2, uma concentração de 0,5 µM de cada iniciador e 2 µl do modelo num volume total de 20 µl. Após incubação de 10 minutos a 95 ° C, a PCR LightCycler foi realizada durante 40 ciclos, cada ciclo constituído por 15 s A 95°C, recozimento a 60°C durante 5 s e extensão a 72°C durante 10 s. A fluorescência foi monitorizada a 530 nm e a especificidade do sinal foi verificada pela análise da curva de fusão.

sendo o ARN do VHC sintético o modelo, a sensibilidade do ensaio único de QRT-PCR em tempo real foi de aproximadamente 103 cópias/reacção do VHC ou 5 × 104 cópias/ml quando o factor de diluição foi calculado. Observou-se uma ampla relação linear (até 6,5 × 108 cópias/reacção) entre o número de ciclos de PCR necessários para detectar um sinal de fluorescência e o número de cópias do VHC. Mediu-se a carga viral sérica de 24 doentes cronicamente infectados com vários genótipos de VHC prevalentes na Austrália (1a, 1b, 2a, 2b, 2c e 3a) (6). Três doentes apresentaram cargas virais abaixo da sensibilidade desta versão do ensaio (5 × 104 cópias/ml), embora tenham sido positivos por um ensaio qualitativo interno de RT-PCR aninhado (19). Os restantes 21 doentes apresentaram cargas virais que variaram entre 2, 8 × 105 e 9, 1 × 106 cópias/ml. Para aumentar a sensibilidade e especificidade do ensaio, foi introduzido um RT-PCR de 15 ciclos, de uma etapa, com um PCR quantitativo Subsequente em tempo real para a segunda fase. Com RNA sintético, o método modificado foi capaz de detectar uma ampla gama de números de cópias do VHC (de 28 a 2.8 × 106 cópias/reação do VHC), mantendo a linearidade. A sensibilidade do ensaio de qRT-PCR aninhado de ciclo limitado foi superior a 28 cópias/reacção (ou 1.400 cópias/ml), que foi aproximadamente 40 vezes superior à do ensaio de qRT-PCR de ciclo único. A sensibilidade deste ensaio compara-se favoravelmente com a dos métodos anteriormente relatados utilizando quantificação em tempo real com tecnologia TaqMan (Roche) e um sistema de detecção de sequência ABI Prism 7700 (Perkin-Elmer), que relataram sensibilidades de 10 cópias/reação (9, 16) e 1000 cópias/reação (12). A sensibilidade do LightCycler (Roche) e da SYBR Green I detection também foi relatada como sendo de 10 cópias/reação (10). Para validar ainda mais esta versão do ensaio, as cargas virais de 16 amostras séricas VHC-positivas, que variaram entre 1 × 103 e 1.2 × 106 cópias/ml (conforme determinado com o Amplicor Monitor de ensaio), mostrou-se correlacionam estreitamente com os resultados obtidos com o aninhada em tempo real ANUAL-ensaio de PCR (r= 0.876, P < de 0,0001, n = 16) (Fig. (Figo.11).

o VHC reproduz-se no fígado, mas poucos estudos tentaram relacionar cargas virais no fígado com resultados clínicos, preferindo examinar o valor preditivo das cargas virais séricas. Este último pode ser considerado um substituto adequado para cargas virais hepáticas se se demonstrar que estão correlacionadas, mas poucos estudos o demonstraram e os resultados notificados até à data não são convincentes. Assim, o ensaio de ciclo limitado aninhado QRT-PCR foi utilizado para medir as cargas hepáticas do VHC. A quantidade de tecido hepático utilizado para análise foi avaliada entre 0, 8 e 8, 1 mg (média = 3.88 ± 2, 1 mg), da qual foram extraídos 2,1 a 12, 9 µg (média = 6, 62 ± 3, 1 µg) de ARN. O rendimento de RNA total média 1.71 × 103 µg/g de tecido hepático, um valor semelhante ao encontrado em um estudo anterior de 1.01 × 103 µg de RNA/g (13). As cargas virais hepáticas variaram entre 3, 0 × 102 a 1, 3 × 106 moléculas de ARN do VHC/µg de ARN total, e a média foi de 2, 38 × 105 ± 3, 55 × 105 cópias/µg de ARN. Foi demonstrada uma correlação entre as cargas virais hepáticas, medidas em termos do número de cópias do VHC por micrograma de ARN total, e as cargas virais séricas medidas com o ensaio Amplicor Monitor, apesar de terem sido fracas (r = 0, 417, n = 20) (13). Outros estudos demonstraram que a carga sérica de ARN do VHC é substancialmente refletida pela quantidade de vírus no fígado sem fornecer coeficientes de correlação (3, 8). Aqui, relatamos pela primeira vez uma correlação estatisticamente significativa entre as medições da carga viral hepática e sérica (r = 0, 689, P = 0.004, n = 15), indicando que o nível de viremia reflecte, de facto, a quantidade de vírus presente no fígado (Fig. (Figo.22).

em estudos anteriores, as medições da carga viral hepática foram expressas como o número de cópias por miligrama de tecido hepático ou o número de cópias por micrograma de RNA total. Neste estudo, mostramos que a unidade parece ser adequado, pois houve uma correlação significativa entre as cargas virais medido em termos do número de cópias por miligrama de tecido hepático e aqueles medido como o número de cópias por microgramas de RNA total (r = 0.937, P < de 0,0001, n = 20) (Fig. (Figo.3).3). Estes resultados são consistentes com os de Moliner et al. (3), que também demonstrou uma estreita correlação entre a carga viral no fígado, expresso como o número de cópias por grama de tecido, e o número de cópias por microgramas do total de celulares RNA (r = 0.85) (3). O número médio de moléculas de RNA do VHC por grama de tecido hepático foi de 2,1 × 108 ± 3.71 × 108, de cerca de 170 vezes maior do que os níveis de RNA no soro (de 1,22 × 106 ± 2,0 x 106 cópias/ml). Esta constatação é semelhante à de Terrault et al. (18), que demonstrou que a relação entre o ARN do VHC, no fígado, e o ARN do VHC, no soro, foi de 103:1. Em contraste, McGuiness et al. (13) verificou-se que o nível do tecido hepático era maior por um factor >104. Esta diferença pode se relacionar ao fato de que o hepática carga viral dos pacientes no estudo anterior, que predominantemente tinha avançado infecção pelo VHC foram em torno de óctuplo superior (de 1,83 × 106 ± 0.75 × 106 cópias/µg de RNA) do que aqueles registrados no presente estudo (2.38 × 105 ± 3.55 × 105 cópias/µg de RNA).

em conclusão, o ensaio QRT-PCR em tempo real é um método sensível, preciso e fiável para a monitorização das cargas do VHC em amostras séricas e hepáticas.