Colocalizarea cu o singură moleculă de înaltă rezoluție a Cy3 și Cy5 atașată la macromolecule măsoară distanțele intramoleculare în timp

materiale și metode

prepararea ADN-ului Duplex. Pentru a face moleculele de ADN duplex de 30 bp, au fost hibridizate două oligonucleotide cu următoarea secvență și modificări (Integrated ADN Technologies, Coralville, IA). Oligonucleotida 5′-GGGTATGGAGATTTTTAGCGGAGTGACAGC-3′ a fost etichetată cu Cy5 la capătul său 5′ și cu Cy3 la capătul său 3′. Oligonucleotida complementară a fost marcată cu biotină la ambele capete.

expresia și purificarea proteinelor. Proteina fluorescentă galbenă (YFP) gena din plasmida p2bac/pFastBac-YFP-M5-CaM (un cadou de la H. Lee Sweeney, Universitatea din Pennsylvania, Philadelphia) a fost șters prin PCR. Codurile plasmidice p2bac/pFastBac-M5-CaM rezultate pentru miozina de pui V care este trunchiată la Glu-1099. Un fermoar de leucină a urmat bobina înfășurată nativă pentru a asigura dimerizarea. Pentru a facilita purificarea, proteina miozină V a fost etichetată n-terminal cu o etichetă de pavilion (DYKDDDDDK). Două baculovirusuri recombinante au fost generate pentru exprimarea proteinelor în celulele Sf9. Unul a codificat miozina v trunchiată și calmodulina Drosophila melanogaster derivată din plasmida p2Bac/pFastBac-M5-CaM. Al doilea virus a codificat lanțul ușor esențial uman derivat din plasmida p2Bac/pFastBac-ELC. Ambii viruși au fost utilizați pentru coinfecția celulelor Sf9. Proteina a fost exprimată și purificată așa cum este descris de Sweeney și colab. (20).

etichetarea și schimbul Calmodulinei. Calmodulina a fost exprimată și etichetată cu Cy3 sau Cy5 după cum urmează: o singură cisteină a fost introdusă în calmodulina de arici de mare prin intermediul mutației Q143C. Această calmodulină a fost exprimată în Escherichia coli și purificată conform descrierii din ref. 21. Calmodulina a fost etichetată fie cu soluții stoc de Cy3-maleimidă, fie cu Cy5-maleimidă (Amersham Biosciences) (în DMSO) la un raport molar de 1,4 ori timp de 20 de minute. Excesul de colorant a fost îndepărtat prin filtrarea gelului în tampon de schimb (mai jos), urmată de absorbția hidrofobă peste noapte pe BioBeads (Bio-Rad). Încorporarea etichetei a fost de 102% pentru Cy3-calmodulin și 75% pentru Cy5-calmodulin. Alicotele au fost depozitate la -80 CT.

schimbul de calmodulină marcată pe miozina V a fost efectuat așa cum este descris, dar cu unele modificări (22). Miozina V (150 nM) a fost incubată cu 0,7 nM calmodulină marcată cu Cy3 și 0,8 nM calmodulină marcată cu Cy5 în tampon de schimb (25 mM KCl/20 mm imidazol HCl, pH 7,4/2 mM MgCl2/1 mm EGTA) la 22 CTC timp de 2 min. Pentru a schimba calmodulinele, s-a adăugat 0,9 mm CaCl2 și amestecul a fost incubat la 22 centi C timp de 5 min. Reacția a fost stinsă cu EGTA de 7 mM. Amestecul de reacție a fost aplicat pe un dispozitiv de ultrafiltrare Nanocep de 100k MWCO (Pall) și spălat de trei ori cu volume egale de AB (mai jos) pentru a purifica miozina V din excesul de calmodulină.

Pregătirea Celulelor În Flux. Celula de flux a fost construită cu un diapozitiv de microscop de sticlă și capace foarte refractare realizate din NLAF21 (VA Optical Labs, San Anselmo, CA) ținute împreună de bucăți de bandă Scotch față-verso.

pentru experimentele cu miozină V, s-au incubat în celula de curgere 15 unqq de biotină-BSA (1 mg·ml-1) timp de 2 min, după care s-au trecut prin celula de curgere 30 unqq de tampon AB (25 mM KCl/25 mm imidazol HCl, pH 7,4/1 mm EGTA/4 mM MgCl2/10 mM DTT/1 mg·ml-1 BSA) pentru a se spăla. Cincisprezece microlitri de 0,5 mg/ml Neutravidină (sonde moleculare) au fost adăugați în celulă și au fost lăsați să incubeze timp de 2 minute, după care s-a făcut o altă spălare cu tampon AB. Celula de curgere a fost incubată cu filamente biotinilate de faloidină actină (250 nM) timp de 5 minute, urmată de o spălare de 100-electil cu tampon AB. În cele din urmă, celula a fost încărcată cu 20 de unqql de tampon imagistic, incluzând miozina v schimbată cu calmodulină, 5 unqqqm calmodulină, 300 Nm ATP, un sistem de regenerare ATP (0,1 mg·ml-1 creatin fosfokinază/1 mm creatină fosfat) și 0,5% (vol/vol) Triton-X 100 pentru a reduce legarea nespecifică. Celula a fost sigilată cu grăsime în vid și imaginată imediat. Concentrația finală a motorului a dus la actină slab decorată și a permis astfel o analiză a moleculelor unice de miozină V.

pentru experimentele ADN, biotina-BSA și Neutravidina au fost încărcate în același mod ca și pentru experimentele cu miozină V, dar spălările au fost făcute cu tampon T50 (10 mm Tris, pH 8,0/50 mM NaCl). Odată ce celula de curgere a avut un strat de Neutravidină, 15 uniclof dsDNA (30 nM) în tampon T50 cu 1 mg·ml-1 BSA au fost curgate și incubate timp de 2 minute, după care au fost curgute 100 unqtl de tampon imagistic. Celula de curgere a fost apoi sigilată cu grăsime în vid și imaginată prompt. Decorarea rezultată a moleculelor de ADN de pe suprafață a fost suficient de rară încât petele fluorescente din diferite molecule s-au suprapus rar.

Configurarea Microscopului. Microscopul cu fluorescență de reflexie internă totală (TIRF) a fost creat așa cum este descris în ref. 8, cu unele modificări (Fig. 5, care este publicat ca informații justificative pe site-ul web PNAS). Grinzile sursei de excitație la 532 nm (coerent, Santa Clara, CA) și 633 nm (JDS Uniphase, San Jose, CA) au fost combinate de o oglindă dicroică și extinse la un diametru de 7 mm. Aceste surse au fost focalizate (distanța focală = 500 mm) pe planul focal din spate al unui obiectiv Olympus 1.65 na 100 TIRF prin intermediul unei linii laser dicroice pe o etapă de translație liniară care permite funcționarea microscopului fie în modurile epifluorescență, fie în modurile TIRF. Obiectivul a fost poziționat sub o etapă de nanotranslație piezoaxială cu buclă închisă, cu două axe, echipată cu senzori capacitivi pentru măsurarea poziției (Physik Instrumente, Auburn, MA). Lumina reflectată care ieșea din diafragma din spate a obiectivului a fost direcționată pe o fotodiodă cadran pentru a furniza un semnal pentru o buclă de feedback de focalizare care a fixat distanța dintre obiectiv și eșantion cu un actuator electrostrictiv (Newport, Fountain Valley, CA). Emisia de fluorescență a fost colectată de obiectiv, trecută prin două filtre de crestătură cu film subțire StopLine (Semrock, Rochester, NY), câte una pentru fiecare sursă de excitație și transmisă printr-un aparat cu vedere dublă care permitea imagistica simultană a canalelor Cy3 și Cy5 pe o singură cameră IXON dv 887 EMCCD (Andor Technology, Belfast, Irlanda). Toate datele au fost imaginate cu un timp de integrare de 0,5 secunde. Crosstalk între cele două canale (10%) probabil distorsionează măsurătorile distanței față de valori mai mici. Cu toate acestea, eroarea noastră experimentală o face nedetectabilă, așa cum arată simulările Monte Carlo în care au fost create și analizate 100 de perechi de imagini modelate de fluorofori unici separați de 10 nm identic cu datele ADN (descrise mai jos). Imaginile simulate ale funcțiilor de răspândire a punctelor fluorescente au fost calculate prin generarea unei distribuții integrate a intensității gaussiene 2D cu un fundal constant la care s-a adăugat zgomotul împușcat. Vârfurile simulate aveau aceleași dimensiuni și raport semnal-zgomot ca și vârfurile reale. Datele simulate cu 10% crosstalk și datele simulate fără crosstalk sunt indistinguizabile de un test Kolmogorov-Smirnov (N 1 = 100, N 2 = 100, p > 0,05).

Analiza Datelor. O cartografiere de înregistrare a canalelor Cy3 și Cy5 a fost efectuată cu fiduciale constând din margele de Transfluosferă de 100 nm (sonde moleculare). Au fost excitați la 532 nm și emit cu un spectru larg de emisii. Mărgeaua a fost detectabilă în ambele canale. Am localizat un singur șirag de mărgele asociat lamei de acoperire, iar cu etapa noastră piezo am pășit-o cu precizie nanometrică într-un model de grilă (cu o distanță de 0,5-centimetri), făcând o imagine la fiecare oprire. Rezultatul final a fost un teanc de 312 imagini care arată talonul în ambele canale în poziții diferite (Fig. 1a).