材料および方法
二重DNA調製。 ３ ０ｂｐの二重鎖ＤＮＡ分子を作製するために、以下の配列および修飾を有する２つのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズした（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉ Ａ）。 オリゴヌクレオチド５’−ＧＧＧＴＡＴＧＧＡＧＡＴＴＴＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＡＣＡＧＣ−３’を、その５’末端にＣｙ５で標識し、その３’末端にＣｙ３で標識した。 相補的オリゴヌクレオチドを両端にビオチンで標識した。
タンパク質の発現および精製。 Ｌｅｅ Ｓｗｅｅｎｅｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏ ｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａからの贈り物）中の黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）遺伝子をＰＣＲによって欠失した。 得られたp2bac/pFastBac-M5-CaMプラスミドは、Glu-1099で切断されたチキンミオシンVをコードする。 ロイシンジッパーは二量体化を確実にするために天然のコイルコイルに続いた。 精製を容易にするために、ミオシンＶタンパク質をＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）でｎ末端にタグ付けした。 二つの組換えバキュロウイルスは、Sf9細胞におけるタンパク質発現のために生成されました。 一つは、切り捨てミオシンVとP2bac/pFastBac-M5-CaMプラスミドから派生したショウジョウバエmelanogasterカルモジュリンをコードしました。 第二のウイルスは、p2bac/pFastBac-ELCプラスミドから誘導されたヒト必須軽鎖をコードした。 両方のウイルスは、Sf9細胞の共感染のために使用されました。 タンパク質を、Ｓｗｅｅｎｅｙらによって記載されたように発現および精製した。 (20).
カルモジュリンのラベリングと交換。 カルモジュリンを発現し、次のようにCy3またはCy5で標識した：単一のシステインは、突然変異Q143Cによってウニカルモジュリンに導入された。 このカルモジュリンをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで発現させ、ｒｅｆ． 21. カルモジュリンを、Ｃｙ３−マレイミドまたはＣｙ５−マレイミド（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ストック溶液（ＤＭＳＯ中）で、１． 過剰な色素を交換緩衝液（以下）へのゲル濾過によって除去し、続いて、Ｂｉｏｂｅａｄｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上への一晩の疎水性吸収を行った。 ラベルの取り込みは、Cy3-カルモジュリンのための102％とCy5-カルモジュリンのための75％であった。 アリコートは-80℃で保存した。
ミオシンVへの標識カルモジュリンの交換は、記載されているように行われたが、いくつかの修正を加えた（22）。 ミオシンV(150nM)を、0.7nM Cy3標識カルモジュリンおよび0.8nM Cy5標識カルモジュリンと交換緩衝液(25mM KCl/20mMイミダゾールHCl、pH7.4/2mM Mgcl2/1mM EGTA)中で22℃で2分間インキュベートした。 カルモジュリンを交換するために、0.9mM Cacl2を添加し、混合物を22℃で5分間インキュベートした。 反応物を７ｍ Ｍ ＥＧＴＡでクエンチした。 反応混合物を１ ０ ０Ｋ Ｍｗｃｏ Ｎａｎｏｃｅｐ限外濾過装置（Ｐａｌｌ）上に塗布し、等量のＡ ｂ（下記）で３回洗浄して、過剰のカルモジュリンからミオシンＶを精製した。
フローセルの準備。 フローセルは、ガラス顕微鏡スライドおよび両面スコッチテープ片によって一緒に保持されたＮＬＡＦ２ １（Ｖ Ａ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｌａｂｓ，Ｓａｎ Ａｎｓｅｌｍｏ，Ｃ Ａ）からなる高度に屈折するカバースリップ＜４ ２ ３ ９＞＜１ ９ ４ ５＞ミオシンＶ実験では、１ ５μ ｌのビオチン−ＢＳ Ａ（１ｍｇ・ｍｌ−１）をフローセル中で２分間インキュベートし、その後、３ ０μ ｌのＡ Ｂ緩衝液（２ ５ｍ Ｍ Ｋｃｌ／２ ５ｍ ＭイミダゾールＨ Ｃ Ｌ、ｐＨ７． ５ｍｇ／ｍｌのＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を１ ５μ ｌ添加し、２分間インキュベートさせ、その後、Ａ Ｂ緩衝液で別の洗浄を行った。 フローセルを、１ ５μ ｌのビオチン化ファロイジンアクチンフィラメント（２ ５ ０ｎＭ）と共に５分間インキュベートし、続いて、Ａ Ｂ緩衝液で１ ０ ０μ ｌ洗浄した。 最後に、細胞は、カルモジュリン交換ミオシンV、5μ mカルモジュリン、300nM ATP、ATP再生システム（0.1mg·ml-1クレアチンホスホキナーゼ/1mMクレアチンリン酸）、および0.5％（vol/vol）Triton-X100を含むイメージングバッファーの20μ lをロードし、非特異的結合を減少させた。 セルを真空グリースで密封し、直ちに撮像した。 最終的なモーター濃度はまばらに装飾されたアクチンをもたらし、したがって、単一のミオシンV分子の分析を可能にした。＜４ ２ ３ ９＞＜１ ９ ４ ５＞ＤＮＡ実験では、ビオチン−ＢＳ ＡおよびニュートラビジンをミオシンＶ実験と同じ方法で負荷したが、洗浄はＴ５ ０緩衝液（１ ０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８． フローセルがニュートラビジンコーティングを有すると、１ｍｇ・ｍｌ−１ＢＳ Ａを含むＴ５ ０緩衝液中の１ ５μ ｌｏｆ ｄｓＤＮＡ（３ ０ｎＭ）を流し、２分間インキュベートし、その後、１ ０ ０μ ｌのイメージングバッ その後、フローセルを真空グリースで密封し、速やかに撮像した。 表面上のＤＮＡ分子の得られた装飾は十分にまばらであり，異なる分子からの蛍光スポットはめったに重複しなかった。
全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡を、参考文献に記載のようにセットアップした。 図8に示すように、いくつかの変形を伴う。 ＰＮＡＳウェブサイト上の支援情報として公開されている）。 ５ ３ ２ｎｍ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、Ｃ Ａ）および６ ３ ３ｎｍ（ＪＤＳ Ｕｎｉｐｈａｓｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、Ｃ Ａ）の励起源ビームを二色性ミラーによって結合し、７ｍｍの直径に拡大した。 これらの源はepifluorescenceまたはTIRFモードの顕微鏡操作を可能にする線形翻訳段階の二色性レーザーラインによってオリンパス1.65NA×100TIRFの目的の背部焦点面に（焦点長=500 目的物を、位置測定のための容量性センサ（Ｐｈｙｓｉｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅ、Ａｕｂｕｒｎ、Ｍ Ａ）を備えた閉ループ、２軸、ピエゾナノトランスレーションステージの下に配置した。 対物レンズの背面開口から出る反射光を象限フォトダイオードに向け、電歪アクチュエータ（Newport,Fountain Valley,CA）で対物レンズとサンプル間の距離をクランプするフォーカスフィードバックループの信号を提供しました。 蛍光発光を、対物レンズによって収集し、各励起源に対して１つの２つのＳｔｏｐｌｉｎｅ薄膜ノッチフィルタ（Ｓｅｍｒｏｃｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を通過させ、単一のＩＸＯＮ ＤＶ８ ８ ７ＥＭＣＣＤカメラ（Ａｎｄｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｌｆａｓｔ、Ｉｒｅｌａｎｄ）上のＣｙ３ すべてのデータを0.5秒の積分時間で撮像した。 二つのチャネル間のクロストーク（10％）は、おそらくより小さな値に向かって距離測定値をバイアスします。 しかし、我々の実験誤差は、100nmで分離された単一の蛍光体のモデル化された画像の10対が作成され、DNAデータ（後述）と同じように分析されたモンテカルロシ 蛍光点広がり関数のシミュレートされた画像は、ショットノイズが追加された一定の背景を持つ統合された2Dガウス強度分布を生成することに シミュレーションされたピークは，実際のピークと同じ次元と信号対雑音比を持っていた。 10%のクロストークを持つシミュレートされたデータとクロストークを持たないシミュレートされたデータは、Kolmogorov-Smirnov検定(N1=100,N2=100,p>0.05)によって区別できません。
データ分析。 Cy3とCy5チャネルの登録マッピングは、100nm TransFluoSphereビーズ（分子プローブ）からなる受託者で行われました。 それらは532nmで励起され、広い発光スペクトルで発光する。 ビーズは、我々のチャネルの両方で検出可能であった。 私達はカバースリップに関連付けられる単一のビードを置き、私達のpiezo段階と私達はあらゆる停止でイメージを取る格子パターンのナノメートルの精密と（0.5μ m 最終結果は、異なる位置の両方のチャネルにおけるビードを示す３ １ ２個の画像の積み重ねであった（図１ ０Ａ）。 1a）。
dnaデータは、matlab(Mathworks,Natick,MA)を使用して自家製のソフトウェアによって分析されました。 このルーチンは、高強度のピクセルを決定することにより、画像内のピークを自動的に検出し、周囲のピクセルが単一の蛍光体に対して予想される強度を ピークを2Dガウス関数に近似してその中心位置を取得する前に、ピークのペアを検索します。 Cy5チャネルにある画素がCy3チャネルにマッピングされ、周囲のcy3画素のピークの探索が行われる。 ピークが見つかった場合、Cy5ピークとCy3ピークは、さらなる分析のためにペアと見なされます。 各ピークは、上記のビーズについて説明したように、それぞれの空間内の2Dガウス関数に適合される（Eq. 1 ). 近似平均位置の誤差は、収集された光子の数（Ny）で計算され、
Cy5の位置はCy3チャネルにマッピングされ、それらの間の距離が計算されます。 DNAデータの計算分析の後、同定されたフルオロフォア対は、ペアがペアの分析に干渉しているだろう他のフルオロフォアに近くなかったことを確認する
ミオシンVのデータは、最初に目で動くモーターを識別することによって分析されました。 Matlabで書かれた自家製のソフトウェアは、上記のように蛍光ピークの開始ペアを2Dガウス関数に適合させ、ユーザーが指定した限りピークを追跡し続けました。 観察されたほとんどのモーターの場合と同様に、共役染料がそれぞれ単一のステップで光漂白されたモーターを分析し、Cy3ラベルとcy5ラベルのみのモーターを研究していたことが確認されました。 得られた軌道は、Cy5軌道をCy3チャネルにマッピングすることによって登録された。 両方の軌道からの点への最小二乗線形フィットは，軌道が投影されたアクチンフィラメントの向きを与えた。 線形適合に沿った距離（アクチンフィラメント）を時間に対してプロットして、ヘッドの相対距離を確認しました（Fig. 4).
アクチンフィラメントに沿って歩いている差動標識ミオシンV分子の時間トレース。 標識（Cy3およびCy5）は、ミオシンV分子上に交換されたカルモジュリンに共有結合的に結合されている。 この痕跡では、蛍光プローブの位置の両方が72nmのステップを取っており、カルモジュリンがモータードメインの近くで交換されたことを示しています。 プローブの交互の位置は、ミオシンVの手の上の手の歩行メカニズムの直接観察を提供します。