La colocalizzazione ad alta risoluzione della singola molecola di Cy3 e Cy5 attaccata alle macromolecole misura le distanze intramolecolari nel tempo

Materiali e metodi

Preparazione del DNA duplex. Per rendere le molecole di DNA duplex 30-bp, sono stati ibridati due oligonucleotidi con la seguente sequenza e modifiche (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). L’oligonucleotide 5 ‘- GGGTATGGAGATTTTTAGCGGAGTGACAGC-3′ è stato etichettato con Cy5 alla sua estremità 5′ e con Cy3 alla sua estremità 3’. L’oligonucleotide complementare è stato etichettato con biotina ad entrambe le estremità.

Espressione e purificazione delle proteine. Il gene della proteina fluorescente gialla (YFP) nel plasmide P2BAC/pFastBac-YFP-M5-CaM (un regalo di H. Lee Sweeney, Università della Pennsylvania, Philadelphia) è stato eliminato dalla PCR. I codici plasmidici P2BAC/pFastBac-M5-CaM risultanti per la miosina V di pollo che viene troncata a Glu-1099. Una cerniera leucina seguiva la bobina a spirale nativa per garantire la dimerizzazione. Per facilitare la purificazione, la proteina miosina V è stata etichettata N-terminale con un FLAG-tag (DYKDDDK). Due baculovirus ricombinanti sono stati generati per l’espressione proteica nelle cellule Sf9. Uno ha codificato la miosina troncata V e la calmodulina Drosophila melanogaster derivata dal plasmide p2Bac / pFastBac-M5-CaM. Il secondo virus ha codificato la catena leggera essenziale umana derivata dal plasmide p2Bac / pFastBac-ELC. Entrambi i virus sono stati utilizzati per la coinfezione delle cellule Sf9. La proteina è stata espressa e purificata come descritto da Sweeney et al. (20).

Etichettatura e scambio Calmodulina. La calmodulina è stata espressa ed etichettata con Cy3 o Cy5 come segue: una singola cisteina è stata introdotta nella calmodulina di ricci di mare mediante la mutazione Q143C. Questa calmodulina è stata espressa in Escherichia coli e purificata come descritto in ref. 21. La calmodulina è stata etichettata con soluzioni stock Cy3-maleimide o Cy5-maleimide (Amersham Biosciences) (in DMSO) ad un rapporto molare di 1,4 volte per 20 min. Il colorante in eccesso è stato rimosso mediante filtrazione in gel nel buffer di scambio (sotto), seguito da assorbimento idrofobo durante la notte su BioBeads (Bio-Rad). L’incorporazione dell’etichetta è stata del 102% per Cy3-calmodulina e del 75% per Cy5-calmodulina. Le aliquote sono state conservate a -80°C.

Lo scambio di calmodulina marcata su miosina V è stato eseguito come descritto ma con alcune modifiche (22). Miosina V (150 nM) è stata incubata con calmodulina marcata con Cy3 0,7 nM e calmodulina marcata con Cy5 0,8 nM in tampone di scambio (25 mm KCl/20 mm imidazolo HCl, pH 7,4/2 mm MgCl2/1 mm EGTA) a 22°C per 2 min. Per lo scambio di calmoduline, è stato aggiunto 0,9 mm CaCl2 e la miscela è stata incubata a 22 ° C per 5 min. La reazione è stata estinta con 7 mm EGTA. La miscela di reazione è stata applicata su un dispositivo di ultrafiltrazione Nanocep 100K MWCO (Pall) e lavata tre volte con volumi uguali di AB (sotto) per purificare la miosina V dalla calmodulina in eccesso.

Preparazione delle celle di flusso. La cella di flusso è stata costruita con un vetrino da microscopio e coprioggetti altamente rifrangenti in NLAF21 (VA Optical Labs, San Anselmo, CA) tenuti insieme da pezzi di nastro biadesivo.

Per gli esperimenti di miosina V, 15 µl di biotina-BSA (1 mg·ml-1) sono stati incubati nella cella di flusso per 2 min, dopo di che 30 µl di tampone AB (25 mm KCl/25 mM imidazolo HCl, pH 7,4/1 mM EGTA/4 mM MgCl2/10 mM DTT/1 mg·ml-1 BSA) sono stati fatti passare attraverso la cella di flusso per lavarlo. Quindici microlitri di neutravidina da 0,5 mg / ml (sonde molecolari) sono stati aggiunti alla cellula ed è stato permesso di incubare per 2 min, dopo di che è stato effettuato un altro lavaggio con tampone AB. La cella di flusso è stata incubata con 15 µl di filamenti di actina di falloidina biotinilata (250 nM) per 5 min, seguita da un lavaggio di 100 µl con tampone AB. Infine, la cellula è stata caricata con 20 µl di buffer di imaging incluso miosina V scambiata con calmodulina, 5 µM calmodulina, 300 nM ATP, un sistema di rigenerazione ATP (0,1 mg·ml-1 creatina fosfochinasi / 1 mm creatina fosfato) e 0,5% (vol/vol) Triton-X 100 per ridurre il legame non specifico. La cella è stata sigillata con grasso sottovuoto e immediatamente imaged. La concentrazione finale del motore ha provocato l’actina scarsamente decorata e quindi ha permesso un’analisi di singole molecole di miosina V.

Per gli esperimenti sul DNA, la biotina-BSA e la neutravidina sono state caricate nello stesso modo degli esperimenti sulla miosina V, ma i lavaggi sono stati fatti con tampone T50 (10 mm Tris, pH 8,0/50 mm NaCl). Una volta che la cella di flusso ha avuto un rivestimento di neutravidina, 15 µl di dsDNA (30 nM) nel buffer T50 con 1 mg·ml-1 BSA sono stati introdotti e incubati per 2 min, dopo di che sono stati introdotti 100 µl di buffer di imaging. La cella di flusso è stata quindi sigillata con grasso sottovuoto e immediatamente imaged. La decorazione risultante di molecole di DNA sulla superficie era sufficientemente scarsa che le macchie fluorescenti di diverse molecole raramente si sovrapponevano.

Configurazione del microscopio. Il microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) è stato impostato come descritto in ref. 8, con alcune modifiche (Fig. 5, che è pubblicato come informazioni di supporto sul sito web PNAS). I fasci di sorgente di eccitazione a 532 nm (Coherent, Santa Clara, CA) e 633 nm (JDS Uniphase, San Jose, CA) sono stati combinati da uno specchio dicroico e espansi fino a un diametro di 7 mm. Queste sorgenti sono state focalizzate (lunghezza focale = 500 mm) sul piano focale posteriore di un obiettivo TIRF Olympus 1,65 NA ×100 mediante una linea laser dicroica su uno stadio di traduzione lineare che consente il funzionamento del microscopio in modalità epifluorescenza o TIRF. L’obiettivo è stato posizionato sotto uno stadio piezo-nanotraslazione a circuito chiuso a due assi dotato di sensori capacitivi per la misurazione della posizione (Physik Instrumente, Auburn, MA). La luce riflessa che esce dall’apertura posteriore dell’obiettivo è stata diretta su un fotodiodo del quadrante per fornire un segnale per un loop di feedback della messa a fuoco che ha bloccato la distanza tra l’obiettivo e il campione con un attuatore elettrostrittivo (Newport, Fountain Valley, CA). L’emissione di fluorescenza è stata raccolta dall’obiettivo, passata attraverso due filtri a tacca a film sottile StopLine (Semrock, Rochester, NY), uno per ogni sorgente di eccitazione, e trasmessa attraverso un apparato a doppia visione che ha permesso l’imaging simultaneo dei canali Cy3 e Cy5 su una singola telecamera iXon DV 887 EMCCD (Andor Technology, Belfast, Irlanda). Tutti i dati sono stati ripresi con un tempo di integrazione di 0,5 secondi. La diafonia tra i due canali (10%) presumibilmente pregiudica le misurazioni della distanza verso valori più piccoli. Il nostro errore sperimentale, tuttavia, lo rende non rilevabile, come dimostrato dalle simulazioni Monte Carlo in cui sono state create 100 coppie di immagini modellate di singoli fluorofori separati da 10 nm e analizzati in modo identico come con i dati del DNA (descritti di seguito). Le immagini simulate delle funzioni di diffusione del punto fluorescente sono state calcolate generando una distribuzione di intensità gaussiana 2D integrata con uno sfondo costante a cui è stato aggiunto il rumore di sparo. I picchi simulati avevano le stesse dimensioni e il rapporto segnale-rumore dei picchi reali. I dati simulati con 10% di diafonia e i dati simulati senza diafonia sono indistinguibili da un test Kolmogorov-Smirnov (N 1 = 100, N 2 = 100, p > 0,05).

Analisi dei dati. Una mappatura di registrazione dei canali Cy3 e Cy5 è stata eseguita con fiduciali costituiti da perline di transfluosfera da 100 nm (Sonde molecolari). Erano eccitati a 532 nm ed emettono con un ampio spettro di emissione. Il tallone era rilevabile in entrambi i nostri canali. Abbiamo individuato un singolo tallone associato al coprioggetto, e con il nostro stadio piezoelettrico lo abbiamo calpestato con precisione nanometrica in uno schema a griglia (con una spaziatura di 0,5 µm), scattando un’immagine ad ogni fermata. Il risultato finale è stato una pila di 312 immagini che mostra il tallone in entrambi i canali in posizioni diverse (Fig. 1 bis).