material och metoder
Duplex DNA-beredning. För att göra 30-bp duplex-DNA-molekylerna hybridiserades två oligonukleotider med följande sekvens och modifieringar (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Oligonukleotiden 5 ’- GGGTATGGAGATTTTTTAGCGGAGTGACAGC-3′ märktes med Cy5 vid dess 5’ – ände och med Cy3 vid dess 3 ’ – ände. Den komplementära oligonukleotiden märktes med biotin i båda ändarna.
proteinuttryck och rening. Den gula fluorescerande proteinet (YFP) genen i p2bac / pFastBac-YFP-M5-CaM plasmid (en gåva från H. Lee Sweeney, University of Pennsylvania, Philadelphia) raderades av PCR. Den resulterande p2bac / pFastBac-M5-CaM plasmidkoder för kyckling myosin V som trunkeras vid Glu-1099. En leucin dragkedja följde den inbyggda spiralspolen för att säkerställa dimerisering. För att underlätta rening märktes myosin V-proteinet n-terminalt med en FLAGGMÄRKE (DYKDDDDK). Två rekombinanta baculovirus genererades för proteinuttryck i Sf9-celler. En kodade den stympade myosin V och Drosophila melanogaster calmodulin härledd från p2bac/pFastBac-M5-CaM-plasmid. Det andra viruset kodade den mänskliga väsentliga ljuskedjan härledd från p2bac / pFastBac-ELC-plasmid. Båda virusen användes för saminfektion av Sf9-celler. Proteinet uttrycktes och renades såsom beskrivits av Sweeney et al. (20).
Calmodulin märkning och utbyte. Kalmodulin uttrycktes och märktes med Cy3 eller Cy5 enligt följande: en enda cystein infördes i havsborrekalmodulin med hjälp av mutationen Q143C. Detta kalmodulin uttrycktes i Escherichia coli och renades såsom beskrivits i ref. 21. Kalmodulin märktes med antingen Cy3-maleimid eller Cy5-maleimid (Amersham Biosciences) lagerlösningar (i DMSO) vid ett 1,4-faldigt molärt förhållande för 20 min. Överskott av färgämne avlägsnades genom gelfiltrering i utbytesbuffert (nedan), följt av hydrofob absorption över natten på BioBeads (Bio-Rad). Etikettinkorporering var 102% för Cy3-kalmodulin och 75% för Cy5-kalmodulin. Alikvoter lagrades vid -80 kcal C.
utbytet av märkt kalmodulin på myosin V utfördes som beskrivet men med vissa modifieringar (22). Myosin V (150 nM) inkuberades med 0,7 nM Cy3-märkt kalmodulin och 0,8 nM Cy5-märkt kalmodulin i utbytesbuffert (25 mM KCl/20 mM imidazol HCl, pH 7,4/2 mM MgCl2/1 mM EGTA) vid 22 kcal C för 2 min. För utbyte av kalmoduliner tillsattes 0,9 mM CaCl2 och blandningen inkuberades vid 22 kcal C i 5 minuter. Reaktionen släcktes med 7 mM EGTA. Reaktionsblandningen applicerades på en 100k MWCO Nanocep ultrafiltreringsanordning (Pall) och tvättades tre gånger med lika stora volymer AB (nedan) för att rena myosin V från överskott av kalmodulin.
Flöde Cell Beredning. Flödescellen konstruerades med ett glasmikroskopglas och mycket Brytande täckglas gjorda av NLAF21 (VA Optical Labs, San Anselmo, CA) hålls samman av bitar av dubbelsidig Scotch tape.
för myosin V-experimenten inkuberades 15 oc biotin-BSA (1 mg·ml-1) i flödescellen i 2 minuter, varefter 30 oc AB-buffert (25 mM KCl/25 mM imidazol HCl, pH 7,4/1 mM EGTA/4 mM MgCl2/10 mM DTT/1 mg·ml-1 BSA) passerade genom flödescellen för att tvätta den. Femton mikroliter av 0,5 mg/ml Neutrovidin (molekylära prober) tillsattes till cellen och fick inkubera i 2 minuter, varefter en annan tvätt gjordes med AB-buffert. Flödescellen inkuberades med 15 oktyl biotinylerade falloidinaktin filament (250 nM) för 5 min, följt av en 100-oktyl tvätt med AB-buffert. Slutligen laddades cellen med 20 kg bildbuffert inklusive kalmodulin-utbytt myosin V, 5 kg kalmodulin, 300 nM ATP, ett ATP-regenereringssystem (0,1 mg·ml-1 kreatinfosfokinas/1 mM kreatinfosfat) och 0,5% (vol/vol) Triton-X 100 för att minska icke-specifik bindning. Cellen förseglades med vakuumfett och avbildades omedelbart. Den slutliga motorkoncentrationen resulterade i glest dekorerad aktin och tillät därmed en analys av enstaka myosin V-molekyler.
för DNA-experimenten laddades biotin-BSA och Neutrovidin på samma sätt som för myosin V-experimenten, men tvättarna gjordes med T50-buffert (10 mM Tris, pH 8.0/50 mM NaCl). När flödescellen hade en Neutrovidinbeläggning flödes 15 oc dsDNA (30 nM) i T50-buffert med 1 mg·ml-1 BSA in och inkuberades i 2 minuter, varefter 100 oc d avbildningsbuffert flödades in. Flödescellen förseglades sedan med vakuumfett och avbildades omedelbart. Den resulterande dekorationen av DNA-molekyler på ytan var tillräckligt gles att fluorescerande fläckar från olika molekyler sällan överlappade.
Mikroskopuppsättning. Det totala interna reflektionsfluorescensmikroskopet (TIRF) sattes upp som beskrivet i ref. 8, med vissa ändringar (Fig. 5, som publiceras som stödjande information på PNAS webbplats). Excitationskällbalkar vid 532 nm (koherent, Santa Clara, CA) och 633 nm (JDS Uniphase, San Jose, CA) kombinerades med en dikroisk spegel och expanderades till en 7 mm diameter. Dessa källor fokuserades (brännvidd = 500 mm) på det bakre fokalplanet för ett Olympus 1.65 NA 100 TIRF-mål med hjälp av en laserlinje dikroisk på ett linjärt översättningssteg som möjliggör mikroskopoperation i antingen epifluorescens-eller TIRF-lägen. Målet placerades under en sluten slinga, tvåaxlig, piezo nanotranslationssteg utrustad med kapacitiva sensorer för positionsmätning (Physik Instrumente, Auburn, MA). Det reflekterade ljuset som lämnade objektets bakre öppning riktades på en kvadrantfotodiod för att ge en signal för en fokusåterkopplingsslinga som klämde fast avståndet mellan målet och provet med ett elektrostriktivt ställdon (Newport, Fountain Valley, CA). Fluorescensutsläpp samlades in av målet, passerade genom två StopLine tunnfilmsfilter (Semrock, Rochester, NY), En för varje excitationskälla, och överfördes genom en dual-view-apparat som möjliggjorde samtidig avbildning av Cy3-och Cy5-kanalerna på en enda IXON DV 887 EMCCD-kamera (Andor Technology, Belfast, Irland). Alla data avbildades med en 0,5 sek integrationstid. Överhörning mellan de två kanalerna (10%) förspänner antagligen avståndsmätningarna mot mindre värden. Vårt experimentella fel gör det emellertid odetekterbart, vilket visas av Monte Carlo-simuleringar där 100 par modellerade bilder av enstaka fluoroforer separerade med 10 nm skapades och analyserades identiskt som med DNA-data (beskrivs nedan). Simulerade bilder av fluorescerande punktspridningsfunktioner beräknades genom att generera en integrerad 2D Gaussisk intensitetsfördelning med en konstant bakgrund till vilken skottbrus tillsattes. De simulerade topparna hade samma dimensioner och signal-brusförhållande som de verkliga topparna. Simulerade data med 10% överhörning och simulerade data utan överhörning är oskiljbara med ett Kolmogorov-Smirnov-test (N 1 = 100, N 2 = 100, p > 0,05).
Dataanalys. En registreringskartläggning av cy3-och Cy5-kanalerna utfördes med fiducials bestående av 100 nm Transfluosfärpärlor (molekylära prober). De var upphetsade vid 532 nm, och de avger med ett brett emissionsspektrum. Pärlan var detekterbar i båda våra kanaler. Vi lokaliserade en enda pärla associerad med täckglaset, och med vårt piezo-steg steg vi det med nanometerprecision i ett rutmönster (med ett 0,5-occumbm-avstånd) och tog en bild vid varje stopp. Slutresultatet var en stapel med 312 bilder som visar pärlan i båda kanalerna i olika positioner (Fig. 1a).
DNA-data analyserades med hemlagad programvara med matlab (Mathworks, Natick, MA). Rutinen lokaliserar automatiskt toppar i bilden genom att bestämma pixlarna med hög intensitet och säkerställer att de omgivande pixlarna har intensiteter som förväntat för en enda fluorofor. Innan vi monterar topparna till en 2D Gaussisk funktion för att få sina centrala platser, söker vi efter par av toppar. Pixlarna som finns i Cy5-kanalen mappas på Cy3-kanalen och en sökning efter toppar i de omgivande Cy3-pixlarna utförs. Om en topp hittas anses Cy5-toppen och Cy3-toppen vara ett par för vidare analys. Varje topp är anpassad till en 2D Gaussisk funktion i sitt respektive utrymme som beskrivs för pärlorna ovan (Eq. 1 ). Felet på fit mean-platsen beräknas med antalet fotoner (Ny) som samlats in, 
Cy5s plats mappas till Cy3-kanalen och avståndet mellan dem beräknas. Efter beräkningsanalysen av DNA-data screenades de identifierade fluoroforparen manuellt för att säkerställa att paren inte var nära några andra fluoroforer som skulle ha stört sig i parens analys.
myosin V-data analyserades genom att först identifiera en rörlig motor med ögat. Hemlagad programvara skriven i matlab passar sedan startparet av fluorescerande toppar till 2D gaussiska funktioner som beskrivits ovan och fortsatte att spåra topparna så länge som användaren angav. Motorer vars konjugerade färgämnen varje fotoblekt i ett enda steg analyserades, vilket var fallet för de flesta av de observerade motorerna, vilket säkerställde att vi verkligen studerade motorer med endast en Cy3-etikett och en Cy5-etikett. De resulterande banorna registrerades genom att kartlägga Cy5-banan på Cy3-kanalen. En minsta kvadrat linjär passform till punkterna från båda banorna gav orienteringen av aktinfilamentet till vilket banorna projicerades. Avstånd längs den linjära passformen (aktinfilamentet) plottades mot tiden för att se huvudets relativa avstånd (Fig. 4).
tidsspår av en differentiellt märkt myosin V-molekyl som går längs en aktinfilament. Etiketterna (Cy3 och Cy5) är kovalent bundna till kalmoduliner som byttes ut på myosin V-molekylen. I detta spår tar båda fluorescerande sondens platser 72-nm-steg, vilket indikerar att kalmodulinerna utbyttes nära motordomänen. Sondernas växlande positioner ger en direkt observation av myosin V: s hand-över-hand-gångmekanism.