izolace a dlouhodobé expanzi primárních buněk, zejména kmenových/progenitorových populací, jsou zásadní a důležité základní techniky v různých biologických oborů, včetně vývojové biologie a kmenových buněk biologie a lékařské vědy. Buněk ve stratifikovaných a cylindrických epiteliálních tkání jsou vysoce regenerační a neúměrně odpovědnost za mnoho lidských nádorů; nicméně, klonování dospělých kmenových buněk je omezen obtíže v udržení těchto buněk v nezralém stavu. V posledních letech, technické inovace mají za následek rychlý a dramatický pokrok v kmenové buněčné biologie, jako je použití malých molekul a růstových faktorů napodobovat tkáně výklenku prostředí a usnadnění „Organoid kultury“ .
v roce 1975 založili Rheinwald a Green první úspěšný příklad kultury lidských dospělých kmenových buněk pomocí lidských keratinocytů . Konkrétně udržovali lidské keratinocyty dlouhodobě v kombinaci se subletálně ozářenou buněčnou linií myších fibroblastů, 3T3-J2. I když neměli používat termín „kmenové buňky“ pro klonovaných keratinocytů pěstované na 3T3, Zelené a kolegové zjistili, kolonie s pozoruhodnou schopnost se dělit a vytvářet nové kolonie po průchodu, který se nazývá „Holoclones“ . Tyto holoclones se skládá z malé, nezralé buňky, které všechny vykazovaly intenzivní jaderné barvení s p63, mistr regulátor z stemness, ve stratifikovaných epitelové buňky . Ve stratifikovaném epitelu, včetně kůže, plicní bronchie, mléčné žlázy a urothelu močového měchýře, byla populace kmenových buněk lokalizována hlavně v bazální vrstvě a nezralé buňky byly obarveny p63, v souladu se studiemi in vitro . Výrazně, izolované a rozšířené lidské keratinocyty z autologní kůže byly úspěšně naroubován na popálených pacientů a regeneruje trvalé epidermis připomínající, že výsledek z split-tloušťka kožní štěpy . Zejména byl stejný postup použit pro izolaci a expanzi epiteliálních buněk lidské rohovky pro transplantaci . I když tato technologie byla omezena na kmenové buňky v epidermis a rohovky v té době, Zelené a kolegové vytvořili základ pro klonování lidských dospělých kmenových buněk v oblasti základní biologie a regenerativní medicíny.
V tomto přezkumu článku nabízíme přehled nedávného výzkumu, pokroku a hromadí se důkazy o systému buněčné kultury, který vedl k technické objevy v epiteliálních buněčných technologií. Román kultury strategií pro oba rozvrstvené epitelové buňky a buňky cylindrického epitelu umožnily rozvoj lidských epiteliálních být zrekapituloval a může být použit pro generování lidských onemocnění model in vitro. Diskutujeme také o možných a možných aplikacích normálních technologií kultivace epitelových buněk pro regenerativní medicínu a zdůrazňujeme systém kultury rakovinných buněk, který reprodukuje jednotlivé fenotypy pacientů.
Rozvrstvené epiteliální buněčné kultury
V rozvrstvené epiteliálních tkání, včetně žláz a pseudostratified epitelu, p63+ buněk, které jsou lokalizovány na bazální membráně, může self-obnovit k udržení kmenových/progenitorových populací a vést k potomstvu, které tvoří funkční tkání . Jak bylo uvedeno výše, klonování a rozšíření epiteliálních kmenových buněk, jako je kůže keratinocytech a epiteliálních buňkách rohovky, byly dobře zavedené v co-kultivační systémy s ozářených myších 3T3-J2 fibroblastů. Tento standardní protokol byl však do značné míry omezen na dlouhodobou kulturu keratinocytů a buněk rohovky. Nicméně, klonovaných kmenových buněk z epitelu thymu byly hlášeny, jak má izolaci z thymu epiteliální kmenové buňky z různých druhů, včetně lidských buněk, kultivovaný s 3T3 systému podavače . Kromě toho, Frey a jeho kolegové nedávno aplikován na 3T3 feeder metoda izolovat urothelial kmenových buněk, které vyjádřil sonic ježek a bydlel v bazální vrstvě močového měchýře urothelium . Tyto urothelial kmenové buňky izolované z lidské a prasečí tkáně byly stabilně rozrostla na 3T3 podavač vrstvy a byli schopni vést na více buněčných linií, včetně p63+ bazální buňky a Uroplakin 2+ a 3+ urothelial buněk, po renální kapsle transplantace u nahých myší. V roce 2011 Pooja et al. využíval kultivační systém 3T3 k izolaci tří typů epiteliálních kmenových buněk lidských dýchacích cest, tj., nosní, tracheální a distální kmenové buňky dýchacích cest a zjistili, že tyto epiteliální kmenové buňky dýchacích cest vykazovaly po diferenciaci in vitro odlišné buněčné fenotypy, i když se nezralé klony kmenových buněk zdály být morfologicky nerozeznatelné (obr. 1) . V navazující studii, transplantace myši tracheální a distálních dýchacích cestách epiteliální kmenové buňky, prokázaly, že distální dýchací cesty kmenové buňky byly snadno začleněny do H1N1-poškození plicní tkáně a rozlišené do několika epiteliálních buněčných typů, tj., bronchioly a alveoly, zatímco transplantované tracheální kmenové buňky byly lokalizovány pouze v hlavních dýchacích cestách . Clonogenic kmenové buňky byly také izolovány z lidského jícnu endoskopická biopsie vzorky, a tyto buňky byly schopné tvořit dobře diferencované, rozvrstvené dlaždicového epitelu-jako struktury v ovzduší tekuté rozhraní (ALI) kultura systém .
Schéma buněčné kultivace lidských rozvrstvené a sloupcovité epiteliální kmenové buňky na 3T3 myší podavač vrstvy. U stratifikovaných epiteliálních kmenových buněk jsou izolovány z biopsie nebo chirurgické vzorky jsou pokoveny na vrstvě 3T3 pro dlouhodobou kulturu. U sloupcových epiteliálních kmenových buněk jsou naneseny na vrstvu 3T3 s definovanými faktory, které jsou nezbytné pro růst a údržbu kmenových buněk. Morfologicky nezralé kolonie (zabalené kolonie s malými buňkami) epiteliálních kmenových buněk jsou mechanicky zachyceny pro další homogenní expanzi. V ALI kultury, buňky podstoupit diferenciace do zralých typů buněk v Transwell
Schlegel a kolegům oznámil, že Rho-associated protein kinázy (ROCK) inhibitor v kombinaci s 3T3 podavač buněk výrazně zvýšená proliferační kapacita epiteliálních kmenových buněk, včetně lidských keratinocytů, buňky prostaty a mléčné žlázy buňky, a nazval tento jev „podmíněné přeprogramování“ . Schopnost efektivně generovat kultury epiteliálních kmenových buněk od pacientů poskytuje kritické a cenné poznatky o buněčné diagnostice a terapeutikách . Více nedávno, Rajagopal a kolegové ukázali, že TGFß/BMP/SMAD signální dráha je důležité v různých epiteliálních tkání, včetně ectoderm-odvozené kůže a mléčné žlázy tkáně, endoderm-odvozené jícnu a prostaty tkáně, a mesoderm-odvozené nadvarlete. Zjistili, že duální inhibice SMAD signalizace (BMP signál byl blokován DMH-1 a TGFß signální byl inhibován A-83-01) umožnil stabilní šíření lidské a myší epiteliální bazální buněčné populace. Překvapivě, duální inhibice TGFß/BMP umožnila robustní expanzi epiteliálních kmenových buněk bez potřeby myších 3T3 feederových buněk.
Kolektivně, tyto technické pokroky, v kombinaci s malými molekulami a podavač buněk, mohou být použity, aby se průběžně a efektivně rozšířit rozvrstvené epiteliálních kmenových/progenitorových populací in vitro. Další průlom ve stratifikované epiteliální kultuře, organoidní kultura, byl využit k rozšíření jak bazálních, tak luminálních předků lidské prostaty. Tyto lidské luminální progenitory byly multipotentní a vytvářely struktury podobné prostatické žláze in vitro . Nicméně, generování trojrozměrné struktury skládající se z vrstevnaté nebo pseudostratified epitelu rekapitulovat autentické in vivo architektury je náročná, i když mnozí badatelé uvádějí, hyperboloidu a organoid kultur. Tento problém může být vyřešen zavedením metody pro usnadnění sebeorganizace, jak se provádí v tkáních odvozených od pluripotentních kmenových buněk .
Sloupcovité epiteliální buněčné kultury
i když střevní kmenové buňky mají pozoruhodnou schopnost množit při vysoké rychlosti obratu k udržení střevní epitel, hepatocyty jsou vysoce regenerativní v reakci na poškození, schopnost klonování kmenových buněk populace z cylindrických epiteliálních buněk je značně omezen, pravděpodobně z důvodu nedostatku tkáně výklenku signálů in vitro. Během posledních deseti let, Chytrých a kolegové objevili LGR5 (leucin-rich repeat-obsahující G-protein coupled receptor 5), střevní kmenových buněk marker, v sofistikované myší model (Lgr5-EGFP-ires-CreERT2 myši zkřížený s Cre-aktivní Rosa26 LacZ reportér) a založil myši střevní organoid kultura metoda, která se skládá z klků-jako struktury a crypt-jako zóny s více střevních buněčných typů . V kombinaci s růstovými faktory a malé-molekuly, koktejly, izolované LGR5+ kmenových buněk frakce byla pozastavena v Matrigel a kultivované dlouhodobým . Změna kultury stavu s použitím nikotinamid, p38 a TGFß receptor, inhibitor, lidské epiteliální buňky, izolované z tenkého střeva a tlustého střeva byli schopni rozšířit nekonečně dlouhodobé in vitro . Tato technika je použitelná pro kultivaci jiných typů buněk, jako jsou buňky pankreatického kanálu a hepatocyty, a usnadnila revoluční pokrok v kultuře sloupcových epiteliálních buněk.
Organoid kultury zaměstnává Matrigel-založené 3D kultury platformy a může být široce používán, aby stabilně kultury různé druhy erotických epiteliálních buněk, včetně rozvrstvené epiteliálních buněk, kmenových/progenitorových buněčných populací . Nicméně, schopnost rychle a efektivně šířit zlomek jednotné kmenové buňky in vitro je také užitečné a důležité pro detailní studium sebeobnovy a osud specifikace v tkáňových kmenových buněk a možné budoucí aplikace transplantace buněk pro regenerativní medicínu. Xian a jeho kolegové nedávno vyvinul novou kulturu, systém pro homogenní expanze lidských fetálních střevních kmenových buněk, včetně tenkého a tlustého střeva buňky. Tento systém používal vrstvu podavače myší 3T3 v kombinaci s růstovými faktory a inhibitory signální dráhy pro robustní expanzi lidských sloupcových epiteliálních kmenových buněk (obr. 1) . Navíc více než 50% střevních kmenových buněk pěstovaných na fibroblastech 3T3 bylo schopno tvořit kolonie. Ve střevě savců, definované specializované faktory, jako jsou signály Wnt a Notch, jsou nezbytné pro řízení kmenovosti střevních kmenových buněk na základně krypty. Kromě toho Panethovy buňky, které jsou také umístěny na základně krypty, vznikají z kmenových buněk a působí jako výklenek kmenových buněk tím, že poskytují základní faktory parakrinním způsobem. Protože organoidní kultury sestávají z kmenových buněk a různých derivátů, jako jsou Panethovy buňky, jsou specializované faktory autonomně dodávány . Naproti tomu, protože čistá populace střevních kmenových buněk je pěstována na krmné vrstvě 3T3, buňky nemohou vylučovat specializované faktory. Proto je třeba doplnit vnější faktory připomínající specializované faktory. Kromě protokolu o udržování kmenových buněk byl v modelu kultury ALI zaveden diferenciační protokol, který vede k vzniku nejméně čtyř typů hlavních střevních buněk, tj. Tvorba střevních klků-jako struktury byl pozorován podle původních typů tkání, jako tenkého a tlustého střeva tkáně (Obr. 1). V odlišném přístupu k kultuře ALI, Kuo a jeho kolegové robustně kultivovali malé kousky myšího novorozeneckého střeva stromálním prvkem dlouhodobě .
stejná strategie byla také použita na klonování lidských žaludečních kmenových buněk získaných z endoskopické biopsie. Konkrétně, clonogenic žaludeční buňky byly stabilně rozšířen na 3T3 podavač vrstva v kombinaci s růstovými faktory a malé molekuly a diferencované do žaludeční epiteliální linie obvykle nacházejí v žaludku, jako pepsinogen-vyjádření hlavní buňky . Kromě klonovaných trávicí orgán kmenových buňkách, vejcovodu progenitorových buněk z distální dělohy trubice, jsou také schopni se nekonečně množit na 3T3 podavač vrstvy v přítomnosti výklenku faktory . Distální vejcovod, fimbria epitel, je jednoduchá sloupcová epitelová vrstva, která se skládá z následujících dvou typů buněk: ciliated buňky, které zvyšují transport gamet, a sekreční buňky, které vylučují hlen. Pomocí mírné modifikace diferenciace protokol pro střevní kmenové buňky, dlouhodobé ALI-kultivované oviductal kmenových buněk vedla k 3D architektury, obsahující jak řasinkami a sekreční buňky, která byla připomínající in vivo epitelu struktury . Schopnost produkovat epiteliálních linií s správné typy buněk z kmenových buněk populace by mohl být užitečným nástrojem pro studium fyziologických epitelové vývoje a homeostázy a rozvíjet akutní a chronické onemocnění modely in vitro.
Rakovinné buněčné kultury
Od prvního rakovinné buněčné linie, HeLa buněčné linie, byla založena z děložního čípku pacienta v roce 1951 , rakovinné buněčné linie stanovena z široké škály typů rakoviny byly široce používány ke studiu pathobiology na rakovinu, a za předpokladu, příležitosti generovat in vivo xenograftových modelů a testování anti-rakovina léky, in vitro a in vivo. I když obrovské pokroky byly provedeny v biologie rakoviny pomocí nádorových buněčných linií, výsledky získané pomocí těchto buněk nemusí dostatečně odrážet složitost onemocnění, jak se původně očekávalo, protože rakovina vykazuje mezi jednotlivými pacienty a intratumor heterogenita, jak odhalil nedávný pokrok v next-generation sekvenování . Přesněji odrážet nádorových fenotypů, včetně pacienta genové mutace stavu a patologie, Welm a kolegové vyvinuli pacienta odvozené xenograft (PDX) modely prsu v nonobese diabetic těžké kombinované imunodeficience (NOD-SCID) myší, které udržuje základní vlastnosti původní nádorů a vystavoval metastatické kapacity na konkrétní weby . Kromě rakoviny prsu modelu, vytvoření různých typů solidních nádorů prokázala proveditelnost PDX modely , které jsou předpokládané k urychlení preklinické testování nových léčby rakoviny a pomoci realizovat cíl „personalizované medicíny“.
Kultura metody pro dospělé kmenové buňky, jako je organoid a napájecí systémy, jsou také použitelné na různé přístupy, které používají pacienta odvozené od nádorových buněk. Konkrétně, Chytrých a kolegové uvádí, že organoid kultura může být použita pro model slinivky břišní , prostaty a kolorektálního karcinomu a ukázal, že původní rakovina vlastnosti, včetně genetické různorodosti a drogové citlivosti, může být zrekapituloval. Proto tento systém nazvali „živou organoidní biobankou“. Tyto technologie by mohly být také použity k izolaci populace kmenových buněk od prekancerózní léze, jako je Barrettův jícen, prekurzor lidského adenokarcinomu jícnu . Izolované a rozšířil barrettova jícnu kmenové buňky byly transformovány zavedením SV40 large T antigen, hTERT, c-myc a xenografted do imunokompromitovaných NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) myší . Jak se očekávalo, Barrettovy kmenové buňky jícnu se u myší transformovaly na nádory podobné adenokarcinomu jícnu. Podobný přístup prokázal, že lidské oviduktální kmenové buňky byly buňkou původu u vysoce kvalitního serózního epiteliálního karcinomu vaječníků . Toto zjištění potvrzuje nedávnou lidskou patologii a důkaz transgenního myšího modelu, který naznačil, že distální oviduktální epitel je tkání původu této rakoviny . V kombinaci se systémem CRISPR/Cas9 byly normální kmenové buňky tlustého střeva postupně transformovány zavedením mutací řidiče, které jsou často detekovány u kolorektálního karcinomu . Výsledným buňkám bylo umožněno vytvářet xenografty v ledvinové kapsli a vykazovaly progresivní transformaci na fenotypy podobné adenokarcinomu charakterizované invazivními a metastatickými vlastnostmi. Celkově schopnost izolovat a kultuře buněk z nádoru a pacienta-uzavřeno normální epitelové tkáně usnadňuje výrobu platformu, která nejen doplňuje klasické in vivo na zvířatech práci v oblasti biologie rakoviny, ale také usnadňuje pacient-specifické genetika a genomika přístupů in vitro.
modelování zánětlivého onemocnění dospělými kmenovými buňkami
modelování lidského onemocnění brání omezená dostupnost lidských nemocných tkání. Nicméně pokroky v kultivaci dospělých kmenových buněk nám umožnily reprodukovat fenotypy onemocnění in vitro rozšířením kmenových buněk a odvozením typů zralých buněk z malých vzorků lidské biopsie. Protože 3D kultivační metody, jako ALI a organoid kultura, poskytovaly struktury, které jsou tvořeny mnoha buněčnými typy a připomínají epitel architektury pozorovány in vivo, měly by být vhodné pro studium zánětlivých onemocnění, včetně infekční a dědičné choroby. Konkrétně je reprodukce fenotypu onemocnění jednoduchá, pokud je znám patogen (nebo hlavní příčina) a cílený typ buněk.
pseudomembranózní kolitida (PMC) je způsobena neúměrně zvýšenou populací Clostridium difficile (C.difficile) po léčbě antibiotiky. C. difficile je Gram-pozitivní, sporulující bakterie, a produkuje vysoké molekulové hmotnosti toxiny TcdA a TcdB, které způsobují tekutiny sekrece, zánět a střevní poškození tkáně. Střevní epiteliální buňky, diferencované z clonogenic střevní kmenové buňky v ALI kultury byly zpochybněny s těmito toxiny, které způsobily ničivé poškození epitelu v čase a závislé na dávce způsobem. Tento výsledek naznačil, že model 3D kultury může být použit k reprezentaci patologie C .difficile. Podobně, účinek na Helicobacter pylori (H. pylori), která způsobuje chronickou gastritidu, žaludeční vředy a rakovinu, byla studována microinjecting H. pylori do organoid kultur. Bakterie infikovaných organoid kultur vystavených zvýšené zánět, jako je NF-kB aktivace a IL8 indukce, a IL8 výraz byl výrazně vyšší v žlázy-typ organoid kulturách než v pit-typ organoid kultur .
dospělé kmenové buňky byly také použity k modelování dědičného onemocnění. Beekman A jeho kolegové hlásili střevní organoidní kulturu odvozenou od pacientů s cystickou fibrózou (CF). CF je způsobena mutací v cystická fibróza transmembránový vodivost regulátor (CFTR), která je obvykle vyjádřena v epiteliálních buňkách mnoha orgánů, jako jsou plíce a zažívací tkání. Ačkoli normální střevní organoidní kultury vykazovaly silný otok v reakci na Forskolin, odpověď na otok nebyla pozorována u organoidních kultur CF . Navíc, když byl mutovaný lokus CFTR korigován pomocí technologie CRISPR / Cas9 ve střevních organoidech pacientů s CF, bylo prokázáno, že korigované geny funkčně fungují . Proto, in vitro diferenciace dospělých kmenových buněk, připomínající in vivo fenotypy s více typy buněk v kombinaci s editační genové technologie, poskytuje výkonné prostředky pro léčení lidských onemocnění a může poskytnout přímý vhled do lidské patologie.
Aplikace epiteliálních kmenových buněk pro regenerativní lékařství
i Přes slibné strategie, které použití lidských embryonálních kmenových (ES) buněk a indukovaných pluripotentních kmenových (iPS) buněk pro aplikace v regenerativní medicíně, několik klinických studiích tyto strategie jsou probíhající, což je částečně způsobeno problémy v lineage specifikace a možnost tumorigenezi. Protože dospělé kmenové buňky jsou v podstatě zavazuje k zvláštní typy tkání, produkující určených buněčných typů je poměrně snadné, a potenciální riziko pro tumorigenezi je nízká. Terapeutické přístupy se tedy zaměřují na použití dospělých kmenových buněk jako zdroje buněk pro transplantaci. I když Zelená a kolegy založil lidských keratinocytů kultivační metoda v roce 1975 a kultivované buňky byly transplantabilní do pacientů s popáleninami nebo chemické zranění, dlouhodobé pěstování jiných typů dospělých kmenových buněk je předmětem podstatné technické překážky. Jak bylo popsáno výše, nedávný technický pokrok překonal toto omezení pro různé typy epiteliálních buněk. Schopnost rychle a efektivně rozšiřovat populace kmenových buněk je proto cenná pro jejich použití v regenerativní medicíně.
Pro příklad, myš Lgr5+ střevní kmenové buňky byly rozšířeny v organoid kultury a transplantovány do poškozené myš tlustého střeva, a engrafted buněk, které byly schopné self-obnovit a diferencované byly zjištěny i po 25 týdnů . V jiném přístupu Zhang K a jeho kolegové využili pro transplantační studii upravené dospělé kmenové buňky. Za prvé, jsou úspěšně kultivovány rohovkové epiteliální buňky v misce bez podavače buňky a pak zjistil, že Pax6 je klíčový transkripční faktor, který odlišuje rohovky kmenové buňky (CSCs) z kožních keratinocytů. Překvapivě, Pax6-zvýšená exprese v keratinocytů vyvolané limbálních kmenových buněk-buněk, a tyto buňky by mohly být transplantovány do poškozené rohovky králíků . Vzhledem k tomu, že keratinocyty jsou snadněji dostupné než CSC, může být tato metoda použitelná pro léčbu onemocnění lidského oka. Poslední dobou, Liu a kol. hlásil atraktivní přístup k opravě a regeneraci tkání, který používal endogenní kmenové buňky. Ve své studii byly charakterizovány epitelové kmenové buňky čočky (LECs), které exprimovaly Pax6 a Bmi1, a vykazovaly regenerační potenciál in vivo. Byla použita metoda chirurgického odstranění katarakty, která zachovává endogenní LECs, a tyto LECs přispěly ke spontánní regeneraci čoček se zrakovou funkcí u králíků, makaků a lidských kojenců. Tato metoda by mohla být terapeutickým průlomem pro léčbu katarakty a potenciálně nahradit implantaci umělé nitrooční čočky .
vzhledem k vysoké míře obratu mnoha epiteliálních buněk je transplantace populací kmenových buněk nezbytná pro dlouhodobou údržbu tkáně. Teoreticky může jedna kmenová buňka rekonstituovat celé tkáně a několik výzkumných skupin empiricky prokázalo tento pojem . Navzdory potenciálu pluripotentních kmenových buněk (PSC), které mohou vést ke vzniku všech typů buněk, tkáňové kmenové buňky odvozené od PSC pravděpodobně nemohou být udržovány v nezralém stavu in vitro. Použití dospělých kmenových buněk pro regenerační medicínu proto představuje významnou výhodu.