Koncepční a praktický přehled cDNA microarray technologie: důsledky pro základní a klinické vědy

Braz J Med Biol Res. října 2005, Objem 38(10) 1543-1552 (Recenze)

koncepční a praktický přehled cDNA microarray technologie: důsledky pro základní a klinické vědy

V. de Mello-Coelho a. K. L. Hess

Departamento de Histologia e Embriologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brazílie

Abstrakt
Text

Korespondence a Poznámky pod čarou

Abstrakt

cDNA microarray je inovativní technologie, která usnadňuje analýzu expresi tisíců genů současně. Využití této metodiky, která se rychle vyvíjí, vyžaduje kombinaci znalostí z biologických, matematických a statistických věd. V této recenzi, jsme se snaží poskytnout přehled principů cDNA microarray technologie, praktické problémy analytického zpracování získaných dat, korelace této metodiky s ostatními metod analýzy dat, jako jsou imunohistochemie v tkáňových mikročipů, a cDNA microarray aplikace v různých oblastech základního a klinických věd.

klíčová slova: Biotechnologie, cDNA microarray, Gene expression, Genomika

Úvod

Geny jsou dědičné jednotky tvoří deoxyribonukleové kyseliny (DNA) sekvence organizována v chromozomech v jádře buňky. Složitý proces transkripce z těchto sekvencí výsledků v generaci messenger ribonukleové kyseliny (mRNA). Tyto mRNA kód pro proteiny, které jsou složeny z aminokyselin, a vykonávají určenou funkci genu (1). Strukturální a funkční vlastnosti buněk a tkání jsou tedy určeny současnou, selektivní a diferenciální expresí tisíců genů.

od posledního desetiletí poskytly studie zahrnující mapování genů, klonování a sekvenování významné informace pro strukturální analýzu odlišných genomů (2,3). Množství informací získaných z těchto šetření vyžaduje organizaci získaných údajů. K uspokojení této potřeby, veřejných databází, které byly vytvořeny pro uložení miliony genových sekvencí a vyjádřil sekvence značek (Est), umožňující vstup do genových sekvencí pro analýzu podobnosti i rozdíly mezi genomy různých druhů (4).

strukturální studie genomů vyvolaly řadu otázek týkajících se funkčního a regulačního chápání profilů genové exprese v odlišných typech buněk a tkáních různých organismů (3,5,6). Technologie DNA microarray byla vyvinuta ke studiu komplexního biologického zpracování zahrnujícího několik tisíc genů (7,8). Jedna taková technologie microarray používá jednotlivé řetězce DNA nebo sondy (oligomery), které jsou potištěny na povrch skla pomocí fotolitografie (9). Další metodikou dna microarray, která je předmětem tohoto přehledu, je komplementární technologie DNA (cDNA) microarray (10). S těchto metodik je možné 1) současně porovnat dynamický výraz vzor tisíců genů v buňkách nebo tkáních, 2) odhalit molekulární rozdíly v odlišných fázích buněčné procesy, např., diferenciaci, proliferaci a indukci apoptózy, 3) identifikovat transkripční rozdíly mezi non-nemocné a patologických podmínek, 4) identifikovat změny v buňkách vzhledem k reakci drog, a 5), k identifikaci nových biomarkerů pro potenciální použití v diagnostiku, prognózu a klinické terapii onemocnění.

zásady cDNA microarray technologie

klasické metodice používané pro detekci a kvantifikaci mRNA v dané buňce se nazývá Northern blot analýzy (11). Hlavní zásadou Northern blot analýzy je hybridizace určitého značeného genu-specifické sondy, aby se mRNA váže na filtru, za účelem zjištění, zda tento gen je přítomen. Další metodou používanou k detekci exprese specifického genu je reverzní transkripční polymerázová řetězová reakce (RT-PCR). RT-PCR zahrnuje použití genově specifických primerů a reverzní transkriptázy k syntéze sekvence cDNA k mRNA. CDNA je pak amplifikována několika koly transkripce této šablony cDNA (12) zprostředkované polymerázou. Existuje několik typů RT-PCR a nejpřesnější z hlediska kvantifikace je metoda RT-PCR v reálném čase, která vyžaduje automatizovaný systém schopný detekovat fluorescenci indukovanou během reakce RT-PCR (12). Během RT-PCR lze expresi určitého genu odvodit jeho porovnáním s konstitutivně exprimovanými geny, také známými jako“ úklidové “ geny.

technologie cDNA microarray, která analyzuje hladiny genové exprese tisíců genů současně, je založena na stejných principech jako u Northern blot a RT-PCR analýz (7,8). V podstatě, cDNA microarray je hybridizace tisíců genů z cDNA na jejich odpovídající cíle na čipu nebo filtru. Současnou výzvou této technologie je však analýza podstatného množství surových numerických dat získaných získáním hybridizačních signálů (13). Výpočetní a biostatistické analýzy jsou nezbytné pro přesné zpracování významných údajů pro konkrétní cíle šetření (Obrázek 1).

Výrobu cDNA microarray matrix

v Poslední době několik společností, navrhli cDNA microarrays zaměřené na specifické genové exprese profilových systémů. Tyto matrice jsou komerčně dostupné biotechnologickými společnostmi, včetně SuperArray Bioscience Corporation a Affymetrix, pro použití za přijatelné ceny. V této části se pokusíme popsat základní kroky při výrobě cDNA microarray matrice.

prvním krokem pro tvorbu cDNA microarray matrix je výběr a zesílení z úplného nebo částečného fragmenty cDNA sekvence, které se budou tisknout na substráty, které budou následně hybridizovány s cílové cDNA sekvence (14,15). Nejběžnější metody výběru sekvencí jsou založeny na následujících zdrojích: 1) gen, dat, jako jsou banky, Unigene, dbEST a GenBank, které poskytují informace o specifické genové funkce a chromozomální lokalizace; 2) klon sbírky nebo k dispozici cDNA sekvence v domovské stránky webu obchodních podniků; 3) vlastní-vyrobené konstrukce cDNA knihovny z cílové buňky nebo tkáně materiál již klonovány a sekvenovány pro EST identifikace. Po výběru jsou fragmenty cDNA amplifikovány PCR na multiwellových mikrodestičkách, čištěny chemickým srážením a poté vyšetřeny na kvalitu a množství gelovou elektroforézou. PCR produkty jsou vytištěny na sklíčko nebo membránu pomocí robotického stroje, microarrayer. Během robotického tisku nebo depozice DNA dostávají kapilární trubice konstantní tlak a sériově ukládají DNA na sklíčko nebo membránu, čímž vytvářejí“ microarray “ design (16). Různé druhy substrátů, včetně sklíčka a nylonové membrány jsou předem ošetřeny, aby se zvýšil jejich hydrofobní poplatky, což má za následek zvýšení celkového dodržování sekvencí DNA na substráty (13). A co je nejdůležitější, indexování dat obsahující umístění tisíců klonů cDNA vytištěných na substrátech se provádí opatrným označením každé mikrodestičky pomocí softwaru určeného pro analýzu databáze. Tato databáze také zahrnuje klonovou identitu (clone ID), název genu, umístění chromozomu a genovou funkci(Funkce).

Hybridizace z cDNA sondy s cílovou DNA microarray matrix

klíčovým faktorem pro úspěšné hybridizace z cDNA sondy na cílovou DNA microarray matrix závisí na kvalitě mRNA z buněk nebo tkání. Kontaminanty sondy RNA s genomovou DNA, proteiny nebo zbytky detergentů mohou vést k falešně pozitivním / falešně negativním údajům.

značení sondy během syntézy cDNA reverzní transkripcí RNA sekvencí závisí na typu použitého cDNA microarray (16). Obecně platí, že když cDNA microarray analýzy se provádí pomocí nylonových membrán jako substrát, sonda RNA je radioaktivně označen začlenění dCTP-P33 nukleotidů během procesu reverzní transkripce (7). V případě cDNA microarray tisknout na sklíčka, radioaktivní nukleotidy (17) a fluorescenční barviva s vysokou účinností sazby z obchodního rejstříku, například cyanines Cy-3 dUTP a Cy-5 dUTP, jsou použity (8). Další informace o typy cDNA microarrays a hybridizace proces (7,8,17-20), viz Tabulka 1.

Analýza nástrojů pro identifikaci genové exprese vzory pomocí cDNA microarray technologie

Nástroje pro analýzu obrovského množství dat získaných z cDNA microarrays jsou stále vyvíjeny. V současné době vyšetřovatelé analyzují data cDNA microarray pomocí různých softwarových programů (21-24). To znamená, že neexistuje jediná metoda pro analýzu obrovského množství dat získaných pomocí této technologie. Použití biostatistických nástrojů je stále důležitější při analýze významu profilů genové exprese.

poskytnout obecnou představu o některé z typů metod používaných k analýze cDNA microarray dat, budeme popsat a diskutovat o kroky, které by mohly bránit procesu analýzy. Nanejvýš důležité je validace výsledků dokončením více opakovaných experimentů. Po získání hybridizačních signálů jsou substráty vizuálně zkoumány pomocí výpočetních programů. V tomto případě se zvažuje kvalita substrátů. Například fuzzy bodové obrazy, sraženiny barviva nebo vzorky se silnými signály pozadí jsou obvykle vyřazeny. Tato analýza je důležitá pro odstranění artefaktů, které mohou vést k detekci falešně pozitivních signálů (16). Různí vyšetřovatelé aplikují metodu odečítání hybridizačních signálů na nespecifické signály v pozadí. V tomto kroku je v závislosti na použitém softwaru možné odečíst signály pozadí následujícími dvěma způsoby: 1) aritmetický průměr nebo medián vyplývající z intenzity signálu mezi pozitivní signály skvrn v podkladu, nebo 2) aritmetický průměr nebo medián nespecifický signál, jako je signál intenzity vyplývající z bezprostřední oblast kolem každé místo, které odpovídá specifický gen signál. Těmito dvěma metodami se aritmetický průměr nebo střední hodnoty odečtou od pozitivního signálu představujícího diferencovaně exprimovaný Gen (16). Získání pozitivní intenzity signálu v sítích lokalizace vytvořených pomocí specifického softwaru je dokončeno v libovolných hodnotách známých jako algoritmy. K těmto hodnotám lze přistupovat přímo v databázovém softwaru, který obsahuje dříve katalogizované informace o každém genu vytištěném na substrátu.

Vzhledem k obrovskému množství současně analyzovány geny a variabilita všechny technické kroky cDNA microarray techniky, je důležité vytvořit faktor úpravy nebo náhrady, které se provádí pomocí dat, normalizace procesu. Existence nespecifických signálů na substrátech, problémy související s množstvím nebo kvalitou RNA před hybridizací nebo variabilita inkorporace sondy RNA mohou vést k narušení normalizace vzorku (14,16). Pro další smysluplnou interpretaci dat provádí normalizační proces srovnávací analýzu aritmetického průměru algoritmů z jednotlivé skupiny s jinou, často zvolenou jako kontrola (24,25). Existuje několik typů normalizačních metod a výběr nejvhodnější metody může být výzvou. Důvodem pro to je, že více experimentální proměnné často brání přesné identifikaci rozdílně vyjádřené geny bez falešně pozitivní/falešně negativní výsledky znehodnocují hodnocení údajů. Matematická, statistická a bioinformatická podpora je v této fázi v technologii cDNA microarray rozhodující.

normalizační metody zahrnují: 1) logaritmický poměr měřených úrovní exprese mezi odlišnými skupinami na základě průměru, mediánu, mediánu rozdílů nebo rozptylu získaných ze všech pozitivních signálů umístěných na substrátech; 2) regresní analýzy, která je hodnocena pomocí korelačního koeficientu nebo Euclidian distance, a je založen na rozdělení reprezentované algoritmy odpovídající signál intenzity v odlišných vzorků ze stejné skupiny, a 3) statistické testy, jako je t-test nebo asociativní analýzy, které berou v úvahu více párových srovnání na základě významné práh P < 0,05 a t-test práh významu korekce, respektive (25,26). Kromě toho, lokálně vážené lineární regrese (lowess) metoda normalizace, často používaných pro fluorescenční pole, účty pro snížení kolísání intenzity hybridizace signály a prostorové umístění spatřen cDNA na snímku (27).

po normalizaci je nejjednodušší metodou pro identifikaci rozdílů mezi vzory genové exprese použití rozdílu poměru mezi vzorkem a jeho vhodnou kontrolou. V tomto případě je stanoven libovolný limit a z této hodnoty je možné vybrat diferencovaně vyjádřené geny pomocí databázového softwaru. Například je možné stanovit 2násobný práh pro identifikaci genů s významnými změnami úrovně exprese. Během tohoto procesu budou geny v tomto rozsahu vybrány a uspořádány do tabulek umístěných v databázi. Geny splňující kritéria výběru lze vizualizovat z databází pomocí softwaru, který zobrazuje samoorganizující se mapy (28,29). Kromě toho mohou být tyto změny v profilech genové exprese mezi odlišnými skupinami vizualizovány v dendrogramech na základě hierarchické shlukovací analýzy (25,29,30). V tomto případě jsou geny, které jsou regulovány dolů, obecně zobrazeny zeleně a geny regulované nahoru jsou obecně zobrazeny červeně. Vzhledem k tomu, že rozdíl v regulaci genů je intenzivnější, tak je jeho příslušná barva. Softwarové programy pro analýzu dat cDNA microarray jsou k dispozici přes Internet.

je důležité poznamenat, že analýza profilů genové exprese získaných technologií cDNA microarray zahrnuje tisíce genů, které jsou analyzovány současně. Před provedením fyziologických studií vybraných genů by měly být výsledky cDNA microarray potvrzeny na úrovni RNA analýzou Northern blot nebo RT-PCR v reálném čase (14). To eliminuje možnost falešně pozitivních výsledků cDNA microarray v důsledku křížové hybridizace mezi geny v rámci stejné genové rodiny. Další potvrzení je také vysoce doporučeno na úrovni bílkovin, jako je analýza Western blot, průtoková cytometrie nebo imunohistochemie. V této souvislosti je v současné době možné vyhodnotit geny na úrovni proteinů pomocí tkáňových microarray testů (31-33). Tissue microarray assay je metoda, která umožňuje zhodnocení až tisíc tkání najednou pomocí specifických markerů. V zásadě jsou malé jádrové biopsie 1 mm nebo méně izolovány z jednotlivých tkáňových bloků vložených parafinem speciálním kovovým zařízením nebo jehlou a umístěny do jiného parafinového bloku uspořádaným způsobem. Výhody této techniky jsou: 1) ekonomika a zachování původních vzorků tkáně získaných pro biopsii pro konstrukci pole; 2), aby se zabránilo technické problémy, protože pole je vyrobena v jediném sklíčko, čímž usnadňuje mytí a barvení technické procesy, a 3) rychlost provádět in situ analýzy současně v několika vzorky tkáně v jednom okamžiku. Klinicky, to je silný techniku použít společně s cDNA microarray analýzy k identifikaci nových biomarkerů pro potenciálního využití jako diagnostických, prognostických a terapeutických nástrojů proti patologických stavů (31,32).

technologie cDNA microarray: aplikace a perspektivy

pokud jde o aplikace, cDNA microarray technologie vede k identifikaci specifických genů a umožňuje vědcům porovnávat profily genové exprese v normální versus patologické podmínky v různých organismů. V oblasti základního výzkumu, cDNA microarray byly použity pro identifikaci role několika genů zapojených do buněčných procesů, jako je buněčná diferenciace, a to prostřednictvím srovnání genové exprese vzory mezi normální a transfektovaly buněčných kultur, například (34). Mnoho výzkumných skupin použilo technologii cDNA microarray ke studiu odlišných typů rakoviny a patogeneze infekčních onemocnění (35-40). V tomto případě, identifikace nových genů nebo změny v genové exprese vzory v tkáních z non-nemocné na nemocné státu, přispěla k lepšímu pochopení molekulární mechanismy regulující nástup a průběh onemocnění. CDNA microarray byl navíc považován za velmi zajímavou metodiku ve farmaceutickém průmyslu. V této souvislosti analýzu profilu genové exprese ve velkém měřítku buněk předloženy různé drogové testy by mohly být relevantní pro klasifikaci potenciální látky pro terapeutické použití (41). Několik příkladů aplikace metodiky cDNA microarray v základních a klinických vědách (34-48) je popsáno v tabulce 2.

analýza cDNA microarray je nákladná metodika, ale množství výsledků generovaných z této technologie je nespornou výplatou. Jakmile centrální jednotka pro výzkum je organizován pro rozvoj této metodiky, různých výzkumníků může využívat výhody používání dříve vytištěný cDNA microarray substráty vyšetřovat rozdílně vyjádřené genů v biologických a klinických oborech. Pro organizaci jednotek cDNA microarray je třeba zvážit multidisciplinární interakci mezi matematickými a biologickými arénami. Jednoduchý hypotetický Schematický model prokazující infrastrukturu mikroarray jednotky cDNA je znázorněn na obrázku 2.

konečně byly vytvořeny centralizované banky obsahující data profilů genové exprese analyzovaných technologií cDNA microarray a jsou k dispozici ke kontrole přes Internet (49,50). Tímto způsobem, různé skupiny po celém světě budou moci porovnat data z vybrané genové profily s ostatními uloženy v molekulární data, jako jsou banky, Gene Expression Omnibus nebo Pole Express, navržený European Bioinformatics Institute (51).

problémem, který omezil prospěšnou interakci mezi různými výzkumnými skupinami pomocí technologie cDNA microarray, je nedostatek standardů pro prezentaci a výměnu výsledků. Pro kompenzaci tohoto problému byla vytvořena minimální informace pro anotaci experimentu Microarray (miame) (52). Pokyny vedoucí ke standardizaci experimentů cDNA microarray byly navrženy společností Micro-array Gene Expression Data Society (MGED). MIAME se v podstatě skládá ze šesti částí: 1) experimentální design; 2) návrh pole; 3) vzorky použité, extrakt přípravky, a hybridizace; 4) postupy a parametry hybridizace; 5) obrazu, kvantifikace, a parametr měření, a 6) typy, hodnoty a specifikace pro normalizaci kontroly. MIAME se stala požadavkem na publikování výsledků cDNA microarray v mnoha vědeckých časopisech. Navíc, různé skupiny, včetně MGED, Rosetta, Agilent a Affymetrix pracovali společně s použitím bioinformatiky na design microarray gene expression (MAGE), což je běžný flexibilní konstrukce platforma, která umožňuje komunikaci mezi různými výzkumnými skupinami pomocí cDNA microarray technologie. MAGE se skládá z následujících: 1) MAGE-ON (object model), centrický datový model, který používá jednotný modelovací jazyk a implementuje požadavky MIAME; 2) MAGE-ML (markup language), což dokumentů, překlad z MAGE-OM XML-based formát dat, a 3) MÁG-SLK, volně přístupný software, který definuje aplikační programátorské rozhraní pro MAGE-OM, což umožňuje export dat do MAGE-ML a následně což má za následek ukládání dat v relační databázi (53).

nedávno byla nanotechnologie široce implementována v různých arénách, jako jsou průmyslové, farmaceutické a vládní aplikace, s cílem zlepšit moderní vědecký pokrok. Vzhledem k jedinečné fyzikální a chemické vlastnosti nanočástic, tyto materiály mají schopnost zvýšit smyslové zařízení, pohonné látky, tkáně předělávání techniky, a lék cílí mechanismy. Kromě toho byla nanotechnologie využita ke zlepšení znalostí microarray (54) a k pomoci při vývoji proteinových nanoarrays (55). V laboratorním prostředí vědci nyní začínají zkoumat potenciální pozitivní / negativní dopad nanočástic na indukci / inhibici genů v buňkách pomocí techniky microarray (56). Konečně kombinace nanotechnologie s technologií microarray dokonce pokročila v současných znalostech genů odlišně regulovaných během chorobných procesů (57,58).

Společně, tyto nástroje mohou přispět k pochopení románu gene funkce v různých genomů a jak souvisí s patogenezi onemocnění u lidí. Vývoj a aplikace technologie cDNA microarray přinesly velký pokrok v objevování léků, diagnostice výzkumu a potenciální genové terapii určené k léčbě různých onemocnění. Tato základní technologie pomáhá vědcům porozumět molekulárním mechanismům zapojeným do mnoha a různých biologických procesů.

9. Sengupta R & Tompa M (2002). Řízení kvality ve výrobě oligo polí: kombinatorický návrhový přístup. Journal of Computational Biology, 9: 1-22.

11. Alwine JC, Kemp DJ & Stark GR (1977). Metoda detekce specifických RNA v agarózových gelech přenosem na diazobenzyloxymethyl-papír a hybridizací pomocí DNA sond. Sborník Národní akademie věd, USA, 74: 5350-5354.

12. Bustin A (2000). Absolutní kvantifikace mRNA pomocí reverzní transkripční polymerázové řetězové reakce v reálném čase. Journal of Molecular Endocrinology, 25: 169-193.

17. Whitney LW & Becker KG (2001). Radioaktivní 33 – P sondy v hybridizaci na skleněné cDNA mikroarrays pomocí nervových tkání. Journal of Neuroscience Methods, 106: 9-13.

19. Shalon D, Smith SJ & Brown PO (1996). Systém DNA microarray pro analýzu komplexních vzorků DNA pomocí hybridizace dvoubarevných fluorescenčních sond. Výzkum Genomu, 6: 639-645.

20. Bertucci F, Bernard K, Loriod B et al. (1999). Problémy s citlivostí při měření expresí založených na poli DNA a výkonu nylonových mikroarrays pro malé vzorky. Lidská Molekulární Genetika, 8: 1715-1722.

22. Kerr MK & Churchill GA (2001). Bootstrapping shluková analýza: hodnocení spolehlivosti závěrů z experimentů microarray. Sborník Národní akademie věd, USA, 98: 8961-8965.

23. Planet PJ, Desalle R, Sidall M et al. (2001). Systematická analýza dat dna microarray: uspořádání a interpretace vzorců genové exprese. Výzkum Genomu, 11: 1149-1155.

24. Tanaka TS, Jaradat SA, Lim MK et al. (2000). Profilování exprese v celém genomu placenty a embrya v polovině těhotenství pomocí 15 000 myších vývojových cDNA microarray. Sborník Národní akademie věd, USA, 97: 9127-9132.

25. Quackenbush J (2001). Výpočetní analýza dat microarray. Nature Genetics, 2: 418-427.

27. Yang YH, Dudoit S, Luu P et al. (2002). Normalizace pro data cDNA microarray: robustní kompozitní metoda zaměřená na systematickou variaci jednoho a více snímků. Výzkum nukleových kyselin, 30: e15.

28. Tamayo P, Slonim D, Mesirov J et al. (1999). Interpretace vzorců genové exprese pomocí samoorganizačních map: metody a aplikace na hematopoetickou diferenciaci. Sborník Národní akademie věd, USA, 96: 2907-2912.

30. Eisen MB, Spellman PT, Brown PO et al. (1998). Shluková analýza a zobrazení expresních vzorců v celém genomu. Sborník Národní akademie věd, USA, 95: 14863-14868.

31. Braunschweig T, Chung JY & Hewitt SM (2004). Perspektivy v tkáňových microarrays. Kombinatorická chemie a vysoká propustnost screeningu, 7: 575-585.

34. Tseng YH, Butte AJ, Kokkotou E et al. (2005). Predikce diferenciace preadipocytů genovou expresí odhaluje roli substrátů inzulinových receptorů a necdinu. Biologie Přírodních Buněk, 7: 601-611.

36. Staudt LM (2001). Fyziologie genové exprese a patofyziologie imunitního systému. Trendy v imunologii, 22: 35-40.

37. Berns A (2000). Genová exprese v diagnostice. Příroda, 403: 491-492.

38. Sawiris GP, Sherman-Baust CA, Becker KG et al. (2002). Vývoj vysoce specializovaného cDNA pole pro studium a diagnostiku epiteliálního karcinomu vaječníků. Výzkum Rakoviny, 62: 2923-2928.

39. Khan J, Wei JS, Ringner M et al. (2001). Klasifikace a diagnostická predikce nádorových onemocnění pomocí profilování genové exprese a umělých neuronových sítí. Přírodní Medicína, 7: 673-679.

40. Chang JC, Hilsenbeck SG & Fuqua SA (2005). Genomické přístupy v léčbě a léčbě rakoviny prsu. British Journal of Cancer, 92: 618-624.

41. Lovett RA (2000). Toxikogenomika. Toxikologové se připravují na genomickou revoluci. Věda, 289: 536-537.

42. Flores-Morales A, Stahlberg N, Tollet-Egnell P et al. (2001). Microarray analýza in vivo účinků hypofyzektomie a léčby růstovým hormonem na genovou expresi u potkanů. Endokrinologie, 142: 3163-3176.

43. Liu K, Li Y, Prabhu V et al. (2001). Augmentace exprese aktivací indukovaných genů odlišuje paměť od naivních CD4+ T buněk a je molekulárním mechanismem pro zvýšenou buněčnou odpověď paměťových CD4+ T buněk. Journal of Immunology, 166: 7335-7344.

44. Hess K, Yang Y, Golech S et al. (2004). Kinetické hodnocení obecných změn genové exprese během aktivace lidských naivních CD4+ T buněk. Mezinárodní Imunologie, 16: 1711-1721.

46. Hacia JG, Fan JB, Ryder O et al. (1999). Stanovení rodových alel pro lidské jednonukleotidové polymorfismy pomocí oligonukleotidových polí s vysokou hustotou. Nature Genetics, 22: 164-167.

49. Miles M (2001). Microarray: ztraceno v bouři dat? Nature Neuroscience, 2: 441-443.

50. Becker KG (2001). Sdílení dat cDNA microarray. Nature Neuroscience, 2: 438-440.

54. Wang X, Jiang N, Feng X et al. (2003). Nový přístup pro vysoce kvalitní zpracování microarray pomocí vizualizační technologie třetího barviva. IEEE transakce na Nanobioscience, 2: 193-201.

56. Berry CC, Charles S, Wells S et al. (2004). Vliv přenosu stabilizovaných magnetických nanočástic na lidské dermální fibroblasty v kultuře. International Journal of Pharmaceutics, 269: 211-225.

57. Crnic I & Christofori G (2004). Nové technologie a nedávný pokrok ve výzkumu metastáz. Mezinárodní žurnál vývojové biologie, 48: 573-581.

korespondence a poznámky pod čarou