DISKUSE
Tato studie poskytuje důkazy, že β-buňky mohou fungovat dobře ve štěpu stránky bez nedalekém non–β-buňky. Aby bylo možné studovat štěpy obohacené β-buňkami, musely být ostrůvky dispergovány do jednotlivých buněk, aby se umožnilo třídění buněk aktivovaných fluorescencí. Naše počáteční studie proto zkoumaly vliv disperze ostrůvků a reaggregace na výsledek transplantace. Když byly dispergované buňky reagovány před transplantací, bylo zapotřebí méně buněk k zvrácení hyperglykémie. Po IPGTTs, reaggregated ostrůvky měl glukózy profil podobný hmotnosti-uzavřeno nediabetických, nontransplanted ovládání myší. Myši transplantované 2, 5 milionu dispergovaných buněk ostrůvků však měly po testu tolerance glukózy ještě nižší hladiny glukózy v krvi. Toto zjištění naznačuje, že transplantace dispergovaných buněk ostrůvků může být účinná za předpokladu, že bude transplantován dostatečný počet. Pokud jsou však ostrůvkové buňky reagovány před transplantací, polovina počtu buněk může obnovit normoglykémii. Tyto výsledky jsou v souladu s několika předchozích studií, které ukázaly, že inzulín sekreční odpovědi jsou sníženy v rozptýlené buňky ostrůvků a jsou zlepšeny reaggregation buněk (24-27). Tento vynikající výsledek může být způsoben pozitivním vlivem buněčné komunikace na sekreci inzulínu a vyvolává otázky, zda jsou agregované buňky odolnější vůči apoptóze. Je pravděpodobné, že dispergované buňky vytvořené shluky in vivo po transplantaci, ale to může nastat poté, co mnoho buněk jsou ztraceny v prvních dnech po transplantaci. Stručně řečeno, je zřejmé, že pro zvrácení hyperglykémie je zpočátku zapotřebí větší počet dispergovaných buněk.
v naší další studii byly dispergované ostrůvkové buňky obohaceny o β-buňky pomocí fluorescenčně aktivovaného třídění buněk. β-buňky byly tříděny podle jejich endogenní fluorescence a dopředného rozptylu (velikosti), jak bylo dříve popsáno (19-21). Pomocí této techniky jsme byli schopni získat buněčné populace ∼95% β-buněk. Tyto frakce obohacené o β-buňky byly poté reagovány před transplantací. Myší, které byly transplantovány s β-buňky obohacené agregáty měl rychlý zvrat hyperglykémie podobným způsobem myším transplantovány s podobným objemem celé ostrůvky. Je třeba poznamenat, že počet β-buněk by byl nižší v transplantacích ostrůvků ve srovnání s transplantacemi β-buněk. Je pravděpodobné, že transplantace β-buněk s čistotou 95% β-buněk obsahovaly ∼o 20% více β-buněk než v ostrůvcích. Nicméně, cílem studie bylo stanovit, zda purifikované β-buňky, transplantované v objemech podobné těm, které používají v transplantaci ostrůvků, může zvrátit diabetes a zjistit, zda β-buněk odvozených z kmenových buněk, by mohlo být užitečné pro transplantace u pacientů s diabetem. Na testy tolerance glukózy, 4 týdny po transplantaci, myší transplantovaných s β-buňky obohacené agregátů se mírně snižují hladinu glukózy v krvi a mají tendenci mít mírně vyšší hladinu inzulínu než ty transplantované s ostrůvky. Do 12 týdnů však nebyl mezi těmito skupinami žádný rozdíl, pokud jde o glukózovou toleranci, hladiny inzulínu nebo obsah inzulínu štěpu. V této experimentální sérii byly nediabetické, netransplantované kontrolní myši s věkem spíše než s hmotností. Zatímco hmotnost transplantovaných myší zůstala stabilní nebo klesla během období diabetu, kontrolní myši pokračovaly v přibírání na váze po celou dobu studie. Jejich špatná tolerance glukózy a vyšší hladiny inzulínu naznačují, že tyto kontrolní myši se staly rezistentními na inzulín. Kromě toho, snížení hladiny glukózy transplantované myši může být vysvětleno skutečností, že krysa ostrůvky byly implantovány, protože potkani mají obvykle nižší hladiny glukózy než myší a může mít nižší set point pro glukózu-stimulované sekrece inzulínu.
tyto výsledky ukazují, že výsledek transplantace agregátů obohacených o β-buňky je podobný výsledku ostrůvků. Transplantace čištěné populace β-buněk byla dříve prokázána Keymeulenem et al. (28) být úspěšný, i když v této studii bylo navrženo, že smíchání endokrinních non-β-buněk s β-buňkami před transplantací zlepšilo funkci štěpu. Ve studii Keymeulen byly štěpy studovány po dobu 64 týdnů spíše než 12 týdnů v této studii. Jejich štěpy β-buněk potkanů a smíšené štěpy β-buněk potkanů plus endokrinní non–β-buňky potkanů fungovaly dobře u potkanů až do ∼20 týdnů, kdy některé štěpy začaly selhat. Do 64 týdnů všechny štěpy, bez ohledu na to, zda obsahovaly purifikované β-buňky nebo β-buňky smíchané s jinými endokrinními non–β-buňkami, částečně nebo úplně selhaly. Implantovali však asi 1, 2-1, 7 milionu β–buněk do potkanů, což lze považovat za minimální hmotnostní model. Tato důkladná studie také ukázala, že β-buňky od starších dárců potkanů nefungují stejně dobře jako β-buňky od mladších dárců potkanů. Studie Keymeulen tedy doplňuje zjištění této studie tím, že obě vykazují působivou funkci štěpů sestávajících z purifikovaných β-buněk. Jiný typ buňky uvnitř ostrůvků, které by mohly potenciálně přispívat k výsledku transplantace je endotelových buněk, které byly hlášeny přispět k revaskularizaci transplantovaných ostrůvků (15,16). Není však jasné, že existuje dostatek těchto buněk, aby mohly smysluplně přispět. Nicméně, to je zřejmé z aktuální studie, že i když endokrinní non–β-buňky a dárce endotelu může být výhodné, aby funkce transplantovaných ostrůvků štěpy, ale nezdá se být zásadní pro úspěšnou transplantaci. Toto zjištění naznačuje, že β-buňky odvozené in vitro z kmenových buněk nebo jiného zdroje by mohly být velmi užitečné pro účely transplantace.
když bylo studováno složení štěpu 12 týdnů po transplantaci, měly agregáty obohacené o β-buňky v štěpech prakticky stejných 5% non–β-buněk, jako tomu bylo v počátečních přípravcích. Ačkoli to nebylo překvapivé, bylo pozoruhodné zjistit, že ostrůvky, které původně měly 25% non–β-buněk, měly v štěpech pouze 5%. Převážná většina těchto buněk jsou α-buňky obsahující glukagon. Pokud se β-buňky obohacené štěpy ztratil non–β-buňky ve stejné míře, jako ostrůvek štěpy, jeden by očekával, že je jen 1% non–β-buňky po transplantaci. Je také zajímavé, že ztráta non–β-buněk v langerhansových ostrůvků štěpy zdálo se zastaví na 5%, což bylo stejné procento non–β-buňky nalezené v β-buňce–obohacený štěpů. V souladu s těmito zjištěními jsme také zjistili, že když byly nezralé neonatální shluky prasečích pankreatických buněk transplantovány do nahých myší, štěpy o mnoho měsíců později byly ∼95% β-buněk (29). Tento jev současných experimentů s krysími ostrůvky lze vysvětlit preferenční smrtí non-β-buněk, jak bylo popsáno výše (30-33). Tyto studie a naše vlastní dospěly k závěru, že pokles je způsoben hlavně buňkami produkujícími glukagon (30-33). Nevíme, zda δ-buňky a PP buňky také zmizí. Periferní lokalizace α-buněk v ostrůvcích hlodavců by je mohla potenciálně učinit zranitelnějšími vůči poškození během izolace. Ačkoli jsme to v této studii podrobně nezkoumali, předchozí studie ukázaly, že to není hlavní důvod ztráty α-buněk po transplantaci. Ve studii Lau et al. (33), ostrůvky implantované do jater ztratily α-buňky 4 týdny po transplantaci, zatímco ostrůvky implantované do ledvin ze stejné izolace ne, což naznačuje, že události související s izolací nezpůsobily ztrátu těchto periferních buněk (33). V této studii ostrůvky implantované intraportálně vykazovaly ztrátu α-buněk, zatímco ostrůvky implantované pod ledvinovou kapsli nevykazovaly žádnou ztrátu α-buněk. V této studii jsme viděli ztrátu non-β-buněk v ostrůvcích pod ledvinovou kapslí 1 týden po implantaci. Jeden rozdíl mezi jejich studie a tato studie je, že implantované ostrůvků do normoglycemic potkanů, vzhledem k tomu, že v této studii, příjemci byly hyperglykemických myší. Je možné, že rozdíly v metabolické zátěži na štěpu ostrůvků mohou ovlivnit přežití α-buněk. Nelze vyloučit, že ztráta α-buněk je rychlejší v místě jater, jako Lau et al. (33) hlášeno. Gunther et al. (31) hlásil ztrátu α-buněk již 2 dny po implantaci do jater diabetických potkanů (31). Protože normální hladiny glukagonu a jiné non–β-buňky odvozené peptidy jsou stále produkován endogenní slinivky břišní, je možné, že non–β-buňky v štěpů zmizí, protože involuce, aby se zabránilo hyperglucagonemia.
hypotetickou otázkou, která může mít jednoho dne praktický význam, je, zda by štěp čistých β-buněk poskytl adekvátní výsledek transplantace. Z hlediska celé tělo metabolické účinky sekreci glukagonu z štěpů, zdá se, že sekrece z štěpy poskytuje minimální ochranu proti akutní hypoglykémie (34), zatím lidských ostrůvků transplantace může zachovat téměř normální hladiny glukózy. Přetrvávající sekrece glukagonu ze slinivky břišní může přispět k homeostáze glukózy, ale opět k malé ochraně před akutní hypoglykémií. Tyto nedostatky glukagon reakce by se příjemci více náchylné k hypoglykémii během cvičení (35,36), ale to je nepravděpodobné, že převažují výhody. Další otázkou je, zda existuje nějaký významný lokální vliv ostrůvkových non-β-buněk na funkci β-buněk. Vzhledem k mikrovaskulární anatomii ostrůvků a fyziologickým experimentům, které ukazují, že non-β-buňky jsou za β-buňkami (13,14), se zdá pravděpodobné, že většina β-buněk není ovlivněna non–β-buňkami. Některé poznatky mohou být poskytnuty našimi měřeními, která určovala, jak daleko byly β-buňky od non–β-buněk. Když jsme kvantifikovali počet β-buněk, které byly v těsné blízkosti non-β-buňky, bylo zjištěno, že 65-75% β-buněk bylo 50 µm z non-β-buňky. Zdá se nepravděpodobné, že by lokální sekrece z non-β-buněk mohla mít v této vzdálenosti velký parakrinní vliv. Navíc ze studií ostatních (37,38) víme, že mikrovaskulatura transplantovaných ostrůvků je velmi odlišná od normálu. Anatomie ostrůvkových štěpů je tedy velmi odlišná od ostrůvků ve slinivce břišní, přesto jsou tyto štěpy stále účinné při zvrácení hyperglykémie u diabetických příjemců.
závěrem jsme zjistili, že agregáty obohacené o β-buňky mohou účinně zvrátit hyperglykémii u myší a že transplantované intaktní ostrůvky jsou vyčerpány v non-β-buňkách. Je proto pravděpodobné, že ne–β-buňky ostrůvků nejsou nezbytné pro úspěšnou transplantaci ostrůvků.