DISKUSSION
Diese Studie liefert Hinweise darauf, dass β–Zellen an einer Transplantationsstelle ohne nahe gelegene Nicht-β-Zellen gut funktionieren können. Um β-Zell-angereicherte Transplantate zu untersuchen, mussten Inseln in einzelne Zellen dispergiert werden, um eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung zu ermöglichen. Unsere ersten Studien untersuchten daher die Wirkung von Inseldispersion und Reaggregation auf das Transplantationsergebnis. Wenn die dispergierten Zellen vor der Transplantation reaggregiert wurden, wurden weniger Zellen benötigt, um die Hyperglykämie umzukehren. Nach IPGTTs hatten reaggregierte Inseln ein Glucoseprofil, das dem Gewicht von nichtdiabetischen, nicht transplantierten Kontrollmäusen ähnelte. Mäuse, denen 2,5 Millionen dispergierte Inselzellen transplantiert wurden, hatten jedoch nach dem Glukosetoleranztest noch niedrigere Blutzuckerwerte. Dieser Befund zeigt, dass die Transplantation von dispergierten Inselzellen effizient sein kann, vorausgesetzt, dass eine ausreichende Anzahl transplantiert wird. Wenn jedoch Inselzellen vor der Transplantation reaggregiert werden, kann die Hälfte der Zellen die Normoglykämie wiederherstellen. Diese Ergebnisse stimmen mit mehreren früheren Studien überein, die gezeigt haben, dass Insulinsekretionsreaktionen in dispergierten Inselzellen verringert und durch Reaggregation der Zellen verbessert werden (24-27). Dieses überlegene Ergebnis kann auf einen positiven Einfluss der Zellkommunikation auf die Insulinsekretion zurückzuführen sein und wirft die Frage auf, ob aggregierte Zellen resistenter gegen Apoptose sind. Es ist wahrscheinlich, dass die dispergierten Zellen nach der Transplantation in vivo Cluster bildeten, dies kann jedoch auftreten, nachdem in den ersten Tagen nach der Transplantation viele Zellen verloren gegangen sind. Zusammenfassend ist es offensichtlich, dass zunächst eine größere Anzahl dispergierter Zellen erforderlich ist, um die Hyperglykämie umzukehren.
In unserer nächsten Studie wurden dispergierte Inselzellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung für β-Zellen angereichert. β-Zellen wurden nach ihrer endogenen Fluoreszenz und Vorwärtsstreuung (Größe) sortiert, wie zuvor beschrieben (19-21). Mit dieser Technik konnten wir Zellpopulationen von ∼ 95% β-Zellen erhalten. Diese β-Zell-angereicherten Fraktionen wurden dann vor der Transplantation reaggregiert. Mäuse, die mit β-Zell–angereicherten Aggregaten transplantiert worden waren, hatten eine schnelle Umkehrung der Hyperglykämie in ähnlicher Weise wie Mäuse, die mit einem ähnlichen Volumen ganzer Inseln transplantiert wurden. Es ist zu beachten, dass die Anzahl der β-Zellen in den Inseltransplantationen im Vergleich zu den β-Zelltransplantationen geringer gewesen wäre. Es ist wahrscheinlich, dass die β-Zelltransplantate mit 95% β-Zellreinheit ∼20% mehr β-Zellen enthielten als in den Inseln. Ziel der Studie war es jedoch festzustellen, ob gereinigte β-Zellen, die in ähnlichen Mengen wie bei der Inseltransplantation transplantiert wurden, Diabetes rückgängig machen können und ob β-Zellen aus Stammzellen jemals für die Transplantation an Diabetiker nützlich sein könnten. In Glukosetoleranztests 4 Wochen nach der Transplantation hatten Mäuse, die mit β-Zell–angereicherten Aggregaten transplantiert wurden, etwas niedrigere Blutzuckerspiegel und tendenziell etwas höhere Insulinspiegel als diejenigen, die mit Inseln transplantiert wurden. Nach 12 Wochen gab es jedoch keinen Unterschied zwischen diesen Gruppen in Bezug auf Glukosetoleranz, Insulinspiegel oder Transplantatinsulingehalt. In dieser Versuchsreihe waren die nichtdiabetischen, nicht transplantierten Kontrollmäuse eher alters- als gewichtsabhängig. Während die Gewichte der transplantierten Mäuse während ihrer Diabetesperiode stabil geblieben oder gesunken waren, nahmen die Kontrollmäuse während der gesamten Studie weiter zu. Ihre schlechte Glukosetoleranz und höhere Insulinspiegel deuten darauf hin, dass diese Kontrollmäuse insulinresistent geworden waren. Darüber hinaus können die niedrigeren Glukosespiegel der transplantierten Mäuse durch die Tatsache erklärt werden, dass Ratteninseln implantiert wurden, da Ratten typischerweise niedrigere Glukosespiegel als Mäuse haben und möglicherweise einen niedrigeren Sollwert für die Glucose-stimulierte Insulinsekretion haben.
Diese Ergebnisse zeigen, dass das Transplantationsergebnis von β-Zell–angereicherten Aggregaten dem von Inseln ähnlich ist. Die Transplantation einer gereinigten Population von β-Zellen wurde zuvor von Keymeulen et al. (28) erfolgreich zu sein, obwohl in dieser Studie vorgeschlagen wurde, dass das Mischen endokriner Nicht–β-Zellen mit β-Zellen vor der Transplantation die Transplantatfunktion verbesserte. In der Keymeulen-Studie wurden die Transplantate für 64 Wochen statt der 12 Wochen in dieser Studie untersucht. Ihre Ratten-β-Zell-Transplantate und gemischten Transplantate aus Ratten-β-Zellen plus endokrinen Ratten–Nicht-β-Zellen funktionierten bei Ratten bis ∼20 Wochen gut, als einige der Transplantate zu versagen begannen. Nach 64 Wochen hatten alle Transplantate, unabhängig davon, ob sie gereinigte β-Zellen oder β-Zellen enthielten, die mit anderen endokrinen Nicht–β-Zellen gemischt waren, teilweise oder vollständig versagt. Sie implantierten jedoch etwa 1,2-1,7 Millionen β-Zellen in Ratten, was als minimales Massenmodell angesehen werden könnte. Diese gründliche Studie zeigte auch, dass β-Zellen von älteren Rattenspendern nicht so gut funktionieren wie β-Zellen von jüngeren Rattenspendern. Damit ergänzt die Keymeulen-Studie die Ergebnisse der vorliegenden Studie dahingehend, dass beide eine beeindruckende Funktion von Transplantaten zeigen, die aus gereinigten β-Zellen bestehen. Ein anderer Zelltyp innerhalb von Inseln, der möglicherweise zum Ergebnis der Transplantation beitragen könnte, ist die Endothelzelle, von der berichtet wurde, dass sie zur Revaskularisation transplantierter Inseln beiträgt (15,16). Es ist jedoch nicht klar, ob es genug dieser Zellen gibt, um einen sinnvollen Beitrag zu leisten. Nichtsdestotrotz ist aus den aktuellen Studien ersichtlich, dass endokrine Nicht–β-Zellen und Spenderendothel für die Funktion von transplantierten Inselchen vorteilhaft sein können Transplantate, Sie scheinen für eine erfolgreiche Transplantation nicht wesentlich zu sein. Dieser Befund zeigt, dass β-Zellen, die in vitro aus Stammzellen oder einer anderen Quelle stammen, für Transplantationszwecke sehr nützlich sein könnten.
Bei der Untersuchung der Transplantatzusammensetzung 12 Wochen nach der Transplantation wiesen die β-Zell–angereicherten Aggregate praktisch die gleichen 5% Nicht–β-Zellen in den Transplantaten auf wie in den Ausgangspräparaten. Obwohl dies nicht überraschend war, war es bemerkenswert zu finden, dass Inseln, die anfänglich 25% Nicht–β-Zellen hatten, nur 5% innerhalb der Transplantate hatten. Die überwiegende Mehrheit dieser Zellen sind Glucagon-haltige α-Zellen. Wenn die β-Zell-angereicherten Transplantate Nicht–β-Zellen in gleichem Maße verloren hätten wie die Insel–Transplantate, hätte man erwartet, dass sie nach der Transplantation nur 1% Nicht-β-Zellen hätten. Es ist auch faszinierend, dass der Verlust von Nicht–β-Zellen in den Insel–Transplantaten bei 5% zu stoppen schien, was der gleiche Prozentsatz von Nicht-β-Zellen war, die in den β–Zell-angereicherten Transplantaten gefunden wurden. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen fanden wir auch, dass, wenn unreife neonatale Schweinepankreaszellcluster in Nacktmäuse transplantiert wurden, die Transplantate viele Monate später ∼ 95% β-Zellen waren (29). Dieses Phänomen der vorliegenden Versuche mit Ratteninseln könnte durch den zuvor beschriebenen bevorzugten Tod der Nicht–β-Zellen erklärt werden (30-33). Diese und unsere eigenen Studien kommen zu dem Schluss, dass der Rückgang hauptsächlich auf Glucagon-produzierende Zellen zurückzuführen ist (30-33). Wir wissen nicht, ob δ-Zellen und PP-Zellen ebenfalls verschwinden. Die periphere Lokalisation von α-Zellen in Nagetierinseln könnte sie möglicherweise anfälliger für Schäden während der Isolierung machen. Obwohl wir dies in der vorliegenden Studie nicht im Detail untersucht haben, haben frühere Studien gezeigt, dass dies nicht der Hauptgrund für den Verlust von α-Zellen nach der Transplantation ist. In einer Studie von Lau et al. (33) hatten in die Leber implantierte Inseln 4 Wochen nach der Transplantation α-Zellen verloren, während Inseln, die aus derselben Isolierung in die Niere implantiert wurden, dies nicht getan hatten, was darauf hindeutet, dass isolationsbedingte Ereignisse den Verlust dieser peripheren Zellen nicht verursacht hatten (33). In dieser Studie zeigten intraportal implantierte Inseln einen Verlust von α-Zellen, während Inseln, die unter die Nierenkapsel implantiert wurden, keinen Verlust von α-Zellen zeigten. In der vorliegenden Studie sahen wir 1 Woche nach der Implantation einen Verlust von Nicht–β-Zellen in Inseln unter der Nierenkapsel. Ein Unterschied zwischen ihrer Studie und dieser Studie besteht darin, dass sie Inseln in normoglykämische Ratten implantierten, während in der vorliegenden Studie die Empfänger hyperglykämische Mäuse waren. Es ist möglich, dass Unterschiede in der metabolischen Belastung des Inseltransplantats das α-Zellüberleben beeinflussen. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass der α-Zellverlust an der Leberstelle schneller ist, wie Lau et al. (33) berichtet. In: Gunther et al. (31) berichteten über den Verlust von α-Zellen bereits 2 Tage nach der Implantation in die Leber diabetischer Ratten (31). Da normale Glucagonspiegel und andere nicht von β–Zellen abgeleitete Peptide immer noch vom endogenen Pankreas produziert werden, ist es möglich, dass die Nicht-β–Zellen in den Transplantaten aufgrund der Involution verschwinden, um eine Hyperglucagonämie zu verhindern.
Die hypothetische Frage, die eines Tages von praktischer Bedeutung sein könnte, ist, ob ein Transplantat aus reinen β-Zellen ein adäquates Transplantationsergebnis liefern würde. In Bezug auf die metabolischen Ganzkörpereffekte der Glucagonsekretion aus Transplantaten scheint die Sekretion aus Transplantaten einen minimalen Schutz gegen akute Hypoglykämie zu bieten (34), dennoch können menschliche Inselchen-Transplantate nahezu normale Glukosespiegel aufrechterhalten. Die anhaltende Glucagonsekretion aus der Bauchspeicheldrüse kann einen gewissen Beitrag zur Glukosehomöostase leisten, aber wiederum wenig Schutz vor akuter Hypoglykämie. Diese mangelhaften Glucagon-Reaktionen könnten die Empfänger anfälliger für Hypoglykämie während des Trainings machen (35,36), aber dies ist unwahrscheinlich, dass die Vorteile überwiegen. Die nächste Frage ist, ob es einen wichtigen lokalen Einfluss von Insel-Nicht-β-Zellen auf die β-Zellfunktion gibt. In Anbetracht der mikrovaskulären Anatomie der Insel und der physiologischen Experimente, die zeigen, dass Nicht–β-Zellen β-Zellen nachgeschaltet sind (13,14), scheint es wahrscheinlich, dass die meisten β-Zellen nicht von Nicht–β-Zellen beeinflusst werden. Einige Erkenntnisse könnten unsere Messungen liefern, die bestimmten, wie weit β-Zellen von Nicht–β-Zellen entfernt waren. Als wir die Anzahl der β-Zellen quantifizierten, die sich in unmittelbarer Nähe einer Nicht–β-Zelle befanden, wurde festgestellt, dass 65-75% der β-Zellen 50µm von einer Nicht–β-Zelle entfernt waren. Es scheint unwahrscheinlich, dass die lokale Sekretion von Nicht–β-Zellen in dieser Entfernung einen großen parakrinen Einfluss haben könnte. Darüber hinaus wissen wir aus Studien anderer (37,38), dass sich das Mikrogefäßsystem transplantierter Inseln stark vom Normalzustand unterscheidet. Somit unterscheidet sich die Anatomie von Inselchen sehr von Inseln in der Bauchspeicheldrüse, aber diese Transplantate sind immer noch wirksam bei der Umkehrung der Hyperglykämie bei diabetischen Empfängern.
Zusammenfassend fanden wir heraus, dass β-Zell–angereicherte Aggregate Hyperglykämie bei Mäusen effektiv umkehren können und dass transplantierte intakte Inseln in Nicht–β-Zellen abgereichert sind. Es ist daher wahrscheinlich, dass Insel-Nicht-β-Zellen für eine erfolgreiche Inseltransplantation nicht essentiell sind.