Braz J Med Biol Res, Květen 2004, Objem 37(5) 625-634
použití reverzní transkripce-PCR pro diagnostiku X-vázaná chronické granulomatózní onemocnění
P., Agudelo-Flórez1, J. a. López1, J. Redher1, M. M. S. Carneiro-Sampaio2, B. T. Costa-Carvalho3, A. S. Grumach4 a a. Condino-Neto1
1Centro de Investigação je Pediatria, a Oddělení Pediatrie a Farmakologie, Fakulta Zdravotnických Věd, State University of Campinas, Campinas, SP, Brazil
2Departamento Imunologie, Ústavu Biomedicínského Vědy, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brazílie.
3disciplína alergie, imunologie a revmatologie, oddělení pediatrie, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP, Brazílie.
4Laboratório Medical Research 56, katedra dermatologie, Lékařská fakulta,, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil
Abstrakt Úvod Pacienti a Metody Výsledky Diskuse Poděkování Korespondence a Poznámky pod čarou
Abstrakt 
Chronické granulomatózní onemocnění (CGD) je dědičná porucha, vrozená imunitního systému, vyznačující se tím, že vadný oxidativní vzplanutí fagocytů a následné zhoršení jejich microbicidal činnosti. Mutace v jedné ze složek NADPH-oxidázy ovlivňují genovou expresi nebo funkci tohoto systému, což vede k fenotypu CGD. Defekty v gp91-phox vedou k X-vázanému CGD, který je zodpovědný za přibližně 70% případů CGD. Vyšetřování vysoce heterogenního genotypu pacientů s CGD zahrnuje analýzu mutací, Northern blot nebo Western blot testy podle konkrétního případu. Cílem této studie bylo pomocí reverzní transkripce (RT)-PCR pro analýzu molekulární vady zodpovědný za X-vázanou CGD v osmi Brazilských pacientů a zhodnotit jeho potenciál pro širší aplikaci molekulární screening v CGD. Celková RNA byla připravena z B-lymfocytů transformovaných virem Epstein B a reverzní transkribována pomocí náhodných hexamerů. Výsledná cDNA byla PCR-amplifikována specifickými a překrývajícími se páry primerů určených k amplifikaci tří oblastí genu gp91-phox: exony 1-5, 3-9 a 7-13. Tato strategie detekovala defektní expresi gp91-phox u sedmi pacientů. Výsledky RT-PCR odpovídaly klinické anamnéze, biochemickým údajům (stanovení uvolňování nitroblue tetrazolium nebo superoxidu) a dostupné analýze mutací ve čtyřech případech. Ve třech dalších případech se výsledky RT-PCR shodovaly s klinickou anamnézou a biochemickými údaji. V jiném případě byla RT-PCR normální i přes klinickou anamnézu kompatibilní s CGD a defektní respirační výbuch. Došli jsme k závěru, že tato nová aplikace RT-PCR analýza – jednoduchý, úsporný a rychlý způsob – vhodné pro screening molekulárních defektů 7 8 X-vázaná CGD pacientů.
Klíčová slova: Superoxid, Fagocyty, Primární imunodeficience, Respirační vzplanutí Neutrofilů, Lidské
Úvod
Chronické granulomatózní onemocnění (CGD) je primární imunodeficience původně popsán v roce 1957 jako klinickou jednotku, ovlivňující mužské děti a jménem, v době, fatální granulomatózní onemocnění z dětství. Hlavní vlastnosti CGD jsou opakované a závažné infekce zahrnující přírodní bariéry organismu, např. dýchacích cest a lymfatických uzlin, a nakonec vnitřní struktury, jako jsou játra, slezina, kosti, a mozek (1-3). Odhadovaný výskyt tohoto vzácného onemocnění je 1/250 000 živě narozených za rok. Infekce jsou obecně způsobeny bakteriemi negativními na katalázu, jako jsou Staphylococcus aureus, gramnegativní bacily a plísňové druhy, jako je Aspergillus, Candida a Nocardia (4,5).
systém NADPH-oxidázy vytváří superoxid a další reaktivní meziprodukty kyslíku, které jsou rozhodující pro mikrobicidní aktivitu fagocytů. Biochemickou vadou v CGD je zhoršení aktivity NADPH-oxidázy a následná neschopnost ničit mikroorganismy (6). Hlavní složky systému NADPH-oxidázy jsou gp91 -, p22 -, p47 -, p67 – a p40-phox. Molekulární defekty způsobující CGD jsou obecně způsobeny nepřítomností, nízkou expresí nebo nefunkčností jedné ze složek NADPH-oxidázy. X-vázaná forma tohoto onemocnění je způsobeno defekty v gp91-phox, těžký řetězec cytochromu b588, a tvoří přibližně 70% všech případů (7,8). Autosomální recesivní formy jsou způsobeny vadami v jednom z cytosolu komponenty NADPH oxidázy (p47 – nebo p67-phox, respektive v 20 a v 5% případů), nebo cytochromu b588 světelný řetěz složka (p22-phox, 5% případů) (9,10). CGD je vysoce heterogenní stav: v mezinárodně udržované databázi X-CGD bylo zaregistrováno více než 300 mutací (8). Mutace byly distribuovány převážně v rámci 13 exonů nebo na hranicích exon/intron genu gp91-phox (CYBB) a téměř 200 těchto mutací je jedinečných.
diagnostika CGD je obecně založena na klinické charakteristiky onemocnění plus vadný NADPH-oxidázy aktivita čemž svědčí abnormální nitroblue trifenyltetrazolium (NBT), dihydrorhodamine 123, nebo superoxid vydání testy (11,12). Ve stimulovaném testu NBT vykazují normální jedinci téměř 100% pozitivní buňky, zatímco u pacientů s CGD je méně než 5% buněk pozitivních (13). Kromě toho jsou buňky od pacientů s variantou CGD pozitivní, ale vykazují pouze velmi nízkou aktivitu (6). Test NBT také detekuje nosiče CGD spojeného s X (matky a sestry). Konečné molekulární CGD diagnóza je stanovena u pacientů s abnormální NBT test nebo respirační vzplanutí aktivity, kteří mají jednu z následujících vlastností: mutace v gp91-, p22-, p47-, nebo p67-phox; chybí mRNA pro jeden z těchto genů detekována pomocí Northern blot analýzy; a/nebo chybějící bílkoviny pro jeden z těchto monoaminooxidázy komponenty pomocí Western blot. Genetická, ale ne molekulární diagnóza může být stanovena demonstrací mateřských bratranců, strýců nebo synovců s abnormálním testem NBT nebo respiračním výbuchem (14). To znamená, že stanovení definitivní diagnózy této vzácné a velmi heterogenní onemocnění vyžaduje složité a drahé metody, jako je například kombinace Northern blot nebo Western blot, a single-strand konformaci analýza polymorfismu (SSCP), následuje sekvenování DNA z několika členů rodiny, všechny prováděné ve vysoké složitosti výzkumu v laboratořích.
metoda reverzní transkripce-PCR (RT-PCR) zahrnuje amplifikaci cDNA PCR. Tuto techniku lze snadno standardizovat v méně sofistikovaných laboratořích. Poskytuje informace o genové expresi a předběžné údaje o struktuře nebo velikosti mRNA defektní složky. RT-PCR se zřídka používá ve výzkumu CGD, omezuje se na patofyziologické studie (15-29). K datu, potenciální použití tohoto užitečného nástroje pro stanovení definitivní diagnózy X-vázané CGD, nejčastější forma, nebyl rozsáhle zkoumán. Cílem této studie bylo vyhodnotit pomocí RT-PCR pro molekulární screening vad zodpovědný za X-vázanou CGD, vzácné a možná misdiagnosed imunodeficience, v osmi Brazilských pacientů.
Pacienti a Metody
Pacienti
Do studie bylo zahrnuto 8 nepříbuzným samcem Brazilských pacientů s pravděpodobnou X-vázaná CGD (2 Černí a 6 Bělochů; věk 2-8 let; výška 88-108 cm; hmotnost 11-19 kg). Pacienti vykazovali klinickou historii opakujících se závažných infekcí, jako je pneumonie, lymfadenitida, jaterní absces, pyodermitida a nežádoucí účinky na imunizaci BCG. Byly předány do naší laboratoře pro biochemické a molekulární diagnostické hodnocení. Písemný informovaný souhlas byl získán od účastníků před zahájením studie. Lékařské Školy Etická komise schválila protokol v souladu s Helsinskou Úmluvou a Brazílie Ministerstvo Zdravotnictví, Rozlišení 196/96.
biochemická diagnóza CGD
biochemická diagnóza CGD byla stanovena podle Panamerické skupiny pro kritéria imunodeficience. Zhoršení aktivity NADPH-oxidázy bylo prokázáno NBT slide testem a / nebo testem uvolňování superoxidových aniontů neutrofily periferní krve a mononukleárními leukocyty (14,30,31). Neutrofily a mononukleární leukocyty byly získány centrifugací vzorků krve přes gradient hustoty Ficoll-Hypak (32).
NBT slide test byl založen na redukci NBT na formazanu aktivovanými leukocyty (31). Test byl proveden tak, jak bylo popsáno výše (30). Více než 95% z 200 normálních neutrofilů stimulovaných 30 nM phorbol 12-myristát 13-acetát (PMA) by mělo být schopno snížit NBT. Nepřítomná reakce nebo <5% pozitivních buněk byly považovány za indikující diagnózu CGD (14).
kvantitativní uvolňování superoxidu neutrofily a mononukleárními leukocyty bylo hodnoceno modifikovaným testem redukce cytochromu c inhibovatelným superoxiddismutázou (33-35). Množství superoxidu propuštěn byl vypočítán pomocí koeficientu extinkce 0,21 nM/cm pro cytochrom c. Výsledky jsou hlášeny jako nmol superoxidu vydané 106 buněk za hodinu. Pacienti s CGD vykazovali méně než 10% kontrolních hodnot.
molekulární Screening vad zodpovědný za X-vázanou CGD
B-lymfocyty z X-vázaná CGD pacientů byly transformovány in vitro s Epstein B virus (EBV) (15,16) s cílem poskytnout bohatý zdroj nukleových kyselin molekulární studie. Linie B buněk transformované EBV reprodukují biochemické a molekulární defekty pacientů s CGD (15,16,36) a eliminují potřebu opakovaných odběrů krve. Krátce, leukocytů periferní krve od X-vázaná CGD pacientů byly kultivovány s supernatanty z B95-8, EBV-výrobce buněčné linie (15,16,36,37), v RPMI 1640 médiu doplněna tepelně inaktivované fetální bovinní sérum (10%), 2 mM L-glutaminu, 100 U/ml penicilinu a 100 µg/ml streptomycin, při 37 ° C ve vlhké atmosféře s 5% CO2. Životaschopnost buněk byla sledována a kultury byly udržovány po celou dobu studie.
vzorky RNA z EBV transformovaných B-buněčných linií byly připraveny metodou guanidin HCl, následovanou srážením ethanolu a kvantifikací standardními metodami (38,39). Vzorky cDNA byly získány reverzní transkripcí 2 µg celkové RNA s horním indexem II RT (GIBCO BRL) a náhodnými hexamery (15). Kvalita mRNA vzorků byla ověřena pomocí PCR amplifikace ß-aktin, konstitutivní gen ovládání (bp 920-943 a bp 1494-1471) (Gen Banka přistoupení Ne. NM001101).
exprese genu gp91-phox byla hodnocena pomocí RT-PCR. Specifické a překrývající se páry primerů (Gen. NM_000397, Tabulka 1) byly použity k amplifikaci (30 cyklů) tří exonických oblastí gp91-phox: 1-5, 3-9 a 7-13. Tato strategie nám umožnila prověřit všechny exony gp91-phox. Produkty PCR byly analyzovány 2% elektroforézou agarózového gelu a obarveny ethidiumbromidem.
relativní exprese genu gp91-phox byla analyzována pomocí softwaru Image Master (Pharmacia-Biotech). Na denzitometrie výsledek za cíl vzorky byly rozděleny pomocí denzitometrie výsledek ß-aktin, konstitutivní genová kontrola, normalizace úroveň považována za analýzu. Výsledky RT-PCR testů byly porovnány s klinickou anamnézou pacienta, biochemickými testy (NBT a / nebo test uvolňování superoxidu) a dostupnými údaji o analýze mutací (http://www.sbi.org.br/Sbi2003/ index.ht).
Výsledky
studovali Jsme 8 mužských pacientů s klinickou historií opakovaných závažných infekcí, podle naší laboratoře biochemické a molekulární diagnostika CGD. Výsledky kluzných testů NBT a testů uvolňování superoxidu jsou uvedeny v tabulce 2. Šest pacientů vykazovalo v testu NBT slide méně než 5% pozitivních leukocytů. Šest pacientů vykazovalo zhoršené uvolňování superoxidu granulocyty a / nebo mononukleárními leukocyty (méně než 10% ve srovnání se zdravými kontrolami). Čtyři pacienti měli v obou testech abnormální výsledky. Všem pacientům předložen alespoň jeden abnormální test a obdrželi diagnózu pravděpodobné, X-vázaná CGD. Matka a sestra pacienta T. B. P. představila NBT slide test, kompatibilní s dopravcem stav X-vázaná CGD. Během sledovaného období jeden pacient (G. M.) zemřel na zápal plic.
dále jsme zkoumali definitivní diagnózu CGD vázaného na X pomocí RT-PCR analýzy exprese genu gp91-phox. Výsledky amplifikace RT-PCR se třemi sadami překrývajících se primerů jsou uvedeny v tabulce 2. Kvalita vzorku mRNA byla kontrolována PCR amplifikací ß-aktinu, konstitutivní kontroly genů. V tomto případě byly získány očekávané normální produkty (Obrázky 1 ,2 a 3).
ve čtyřech případech bylo možné porovnat data RT-PCR s dostupnou analýzou mutací, kterou jinde prezentovali Patiño et al. (30) nebo naší skupinou ( //www.sbi.org.br/Sbi2003/index.htm): J. E. M. představil přechod C469®T v exonu 5, předpovídající nesmyslnou mutaci (R157X). M. F. představil nesmyslnou substituci v exonu 3, R (arginin) 73-Stop. R. S. ukázal substituci 264 g®a na 3′ spojovacím spojení gp91-phox exon 3. Na cDNA sekvence ukázal smazání gp91-phox exon 3, což vede k nestabilní nebo nefunkční mutant gp91-phox. G. G. prezentovány defektní sestřih gp91-phox exon 3 (základní mutace dosud nebyla stanovena). Ostatní pacienti jsou nadále vyšetřováni.
jako celek tato strategie umožnila detekci defektní exprese gp91-phox u sedmi z osmi pacientů. Výsledky RT-PCR odpovídaly klinické anamnéze, biochemickým údajům (NBT nebo test uvolňování superoxidu) a dostupné analýze mutací ve čtyřech případech. Ve třech dalších případech se výsledky RT-PCR shodovaly s klinickou anamnézou a biochemickými údaji. V jiném případě, RT-PCR bylo normální, přes klinické historie kompatibilní s CGD, defektní respirační vzplanutí vyznačuje tím, NBT test a superoxid release assay a NBT testů jeho matka a sestra kompatibilní s X-spojený CGD dopravce stav.
Diskuse
Tento dokument informuje o biochemické a genové exprese studie 8 nesouvisí Brazilské mužských pacientů s klinickou historii CGD, kteří byli podle naší laboratoře k podrobnému vyšetřování. CGD je vzácná dědičná porucha, při které fagocytární buňky nejsou schopny generovat superoxidový aniont a další reaktivní meziprodukty kyslíku. Původně jsme stanovena diagnóza pravděpodobné, X-vázaná CGD pomocí biochemických metod, jako NBT slide testy a/nebo superoxid anion vydání testech. Naše výsledky ukázaly, že všichni pacienti vykazovali zhoršenou funkci NADPH-oxidázy a naopak pravděpodobnou CGD spojenou s X.
obě metody přispívají k pravděpodobné diagnóze CGD různými způsoby. NBT slide test poskytuje informace o počtu buněk, které snižují NBT na formazanu uvnitř cytoplazmy a intenzita tohoto omezení. Pacienti s variantními formami CGD vázaného na X tedy vykazují abnormální testy NBT slide, ve kterých většina buněk slabě redukuje NBT na formazan. Test NBT slide také detekuje ženské nosiče CGD spojeného s X. Superoxide release assay opatření na redukci cytochromu c pomocí superoxid produkován aktivovanými leukocyty přítomné v reakci, umožňující diagnostiku variantní formy X-vázaná CGD. Oba testy lze snadno standardizovat v laboratořích s nízkou složitostí a ani jeden nevyžaduje drahé vybavení. Test dihydrorhodaminu 123 je vysoce citlivou metodou pro biochemickou diagnostiku CGD; vyžaduje však průtokový cytometr, velmi drahý nástroj.
hodnotili jsme expresi genu gp91-phox v EBV transformovaných B lymfocytech od pacientů s CGD pomocí RT-PCR analýzy. Specifické a překrývající se páry primerů byly použity k amplifikaci tří oblastí genu gp91-phox RT-PCR: exony 1-5, 3-9 a 7-13. Tato strategie umožnila detekci defektní exprese gp91-phox u 7 z 8 pacientů. Výsledky RT-PCR odpovídaly klinické anamnéze, biochemickým údajům (NBT nebo test uvolňování superoxidu) a dostupné analýze mutací ve čtyřech případech. Ve třech dalších případech se výsledky RT-PCR shodovaly s klinickou anamnézou a biochemickými údaji.
gp91-phox genové exprese byla snížena ve všech exonic regionech pacient R. B. Toto snížení může být výsledkem mutací vedoucích k nízké RNA stability nebo změněné transkripční aktivitu. Pacienti G. M. A T. P. ukázal, nepřítomný výraz exons 7-13, což naznačuje, že snížená exprese těchto dalších 3′-konci exons může být důsledkem nestability RNA nebo sestřih vady, např. částečně správné splétání produkovat signál, ale částečně abnormální sestřih odstranit primer vazebné místo, téma, které mají být zkoumány budoucí genomické DNA mutační analýzy.
Pacient g. G. představila difuzní, nízké množství, menším produkt exons 1-5 (Obrázek 1), a chybí vyjádření druhé exonic regionů. Jeho mutační analýza ukázala defekt v místě spojení exon 3. Podobně mutační analýza pacienta R. S. také odhalila defekt v místě spojení exon 3. V tomto případě by však mohl být detekován méně hojný produkt PCR.
Pacientka M. F. prezentovány snížena exprese exonic regionů 3-9 a 7-13, což může být výsledkem vadného transkripční aktivity v exonu 3. J. E. M. představil nesmyslnou mutaci v exonu 5, která vedla ke ztrátě exprese gp91-phox, o čemž svědčí RT-PCR analýza, možný důsledek nestability mRNA zprostředkované nesmysly.
V jednom případě pacient T. P. B., exprese genu gp91-phox byla normální navzdory rodinné anamnéze kompatibilní s CGD a defektní respirační prasknutí. V tomto případě byla diagnóza pravděpodobného CGD spojeného s X založena na abnormálních testech NBT u jeho matky a jeho sestry, kompatibilních se stavem nosiče. Předpokládáme, že v tomto konkrétním případě by měla být zkoumána bodová mutace, jako je substituce jedné báze, která nemění délku nebo hojnost fragmentu PCR.
RT-PCR je mocný nástroj pro hodnocení genové exprese. Tato vlastnost může částečně vysvětlit variabilitu gp91-phox genové exprese u pacientů zahrnutých do této studie, a že je důležité spojit překrývající se dvojice primerů na obrazovku plnou délku zprávy. RT-PCR byl použit v izolovaných případových studiích jako součást počáteční diagnózy různých forem CGD (17-22). RT-PCR analýza byla také užitečná při prenatální diagnostice CGD, vyplývající z nedostatku P47-phox (23). Častěji se však používá pro studium genové regulace složek NADPH-oxidázy v různých buňkách (15,16,24-29). K datu, potenciální použití tohoto užitečného nástroje pro stanovení definitivní diagnózy X-vázané CGD, nejčastější forma, nebyl rozsáhle zkoumán. Další studie by měly být provedeny porovnat citlivost a specifičnost tohoto testu ve srovnání s jinými komplexní testy jako je Západní nebo Severní skvrny.
Celkově jsme prokázali, že RT-PCR, jednoduché a nízké náklady metodologie, byla stanovena konečná diagnóza X-vázaná CGD v 7 z 8 případů, aniž by bylo nutné používat složité a drahé metody, jako jsou Northern blot, slot blot, SSCP analýzu, nebo genomické DNA sekvenování. RT-PCR tak může být vhodným nástrojem pro diagnostiku CGD v laboratořích v rozvojových zemích. To je velmi důležité pro určení konečného molekulárně genetické vady s cílem poskytnout odpovídající genetické poradenství a prognózu na pokolení s CGD. Kromě toho, molekulární genetické studie lidské NADPH-oxidázový systém bude předem znalosti o této zásadní a starověké obranný mechanismus.
2. Přistání BH & Shirkey HS (1957). Syndrom rekurentní infekce a infiltrace vnitřností pigmentovanými lipidovými histiocyty. Pediatrie, 20: 431-442.
3. Patterson EL, Milstrey R & Stokstad ELR (1975). Účinek selenu v prevenci exsudativní diatézy u kuřat. Sborník společnosti pro experimentální biologii a medicínu, 95: 617-620.
5. Forrest CB, Forehand JR, Axtell RA, Roberts RL & Johnston Jr RB (1988). Klinické příznaky a současná léčba chronického granulomatózního onemocnění. Hematologie / onkologické kliniky Severní Ameriky, 2: 253-266.
6. Curnutte JT (1993). Chronické granulomatózní onemocnění: řešení klinické hádanky na molekulární úrovni. Klinická imunologie a imunopatologie, 67: S2-S15.
7. Dinauer MC, Orkin SH, Brown R, Jesaitis AJ & Parkos CA (1987). Glykoprotein kódovaný lokusem chronické granulomatózní choroby spojeným s X je součástí komplexu neutrofilních cytochromů b. Příroda, 327: 717-720.
9. Clark RA, Malech HL, Gallin JI, Nunoi H, Volpp BD, Pearson DW, Nauseef WM & Curnutte JT (1989). Genetické varianty chronického granulomatózního onemocnění: Prevalence nedostatků dvou cytosolických složek systému NADPH oxidázy. New England Journal of Medicine, 321: 647-652.
10. Cross AR, Noack D, Rae J, Curnutte JT & Heyworth PG (2000). Hematologicky důležité mutace: autozomálně recesivní formy chronické granulomatózní nemoci (první aktualizace). Krevní buňky, molekuly a nemoci, 26: 561-565.
11. Smith RM & Curnutte JT (1991). Molekulární základ chronické granulomatózní nemoci. Krev, 77: 673-686.
12. Vowells SJ, Fleisher TA, Sekhsaria S, Alling DW, Maguire TE & Malech HL (1996). Genotyp-závislé variability pro průtokovou cytometrii hodnocení snížena nikotinamidadenindinukleotid fosfát oxidáza funkce u pacientů s chronickou granulomatózní onemocnění. Journal of Pediatrics, 128: 104-107.
15. Condino-Neto a & Newburger PE (1998). Aktivita NADPH oxidázy a obsah cytochromu b558 v transformovaných B lymfocytech lidského viru Epstein-Barrové korelují s expresí genů kódujících složky oxidázového systému. Archivy biochemie a biofyziky, 360: 158-164.
16. Condino-Neto a & Newburger PE (2000). Interferon-gama zlepšuje sestřih účinnost CYBB genu přepisy v interferon-citlivý varianta X-vázaná chronické granulomatózní onemocnění v důsledku splice site konsensu oblasti mutace. Krev, 95: 3548-3554.
19. Bonizzato A, Russo MP, Donini M & Dusi S (1997). Identifikace dvojité mutace (D160V-K161E)v genu p67phox u pacienta s chronickým granulomatózním onemocněním. Biochemické a biofyzikální výzkumné komunikace, 231: 861-863.
21. Noack D, Heyworth PG, Newburger PE & Cross AR (2001). Neobvyklá intronická mutace v genu CYBB, která vede k chronickému granulomatóznímu onemocnění. Biochimica et Biophysica Acta, 1537: 125-131.
22. Roesler J, Curnutte JT, Rae J, Barrett D, Patino P, Chanock SJ & Goerlach A (2000). Rekombinace mezi p47-phox genu a jeho vysoce homologní pseudogenes jsou hlavní příčinou autozomálně recesivní chronické granulomatózní onemocnění. Krev, 95: 2150-2156.
23. De Boer M, Singh V, Dekker J, Di Rocco M, Goldblatt D & Roos D (2002). Prenatální diagnostika ve dvou rodinách s autosomálně, p47(phox)-nedostatečné chronické granulomatózní onemocnění v důsledku nové bodové mutace v NCF1. Prenatální Diagnóza, 22: 235-240.
24. Baehner RL, Millar-Groff S & Bringas P (1999). Vývojová exprese složek NADPH fagocytární oxidázy v myších embryích. Pediatrický Výzkum, 46: 152-157.
25. Banerjee R, Anguita J, Roos D & Fikrig E (2000). Cutting edge: infekce agentem lidské granulocytární ehrlichiózy zabraňuje respiračnímu výbuchu regulací gp91phox. Journal of Immunology, 164: 3946-3949.
26. Bayraktutan U, Blayney L & Shah AM (2000). Molekulární charakterizace a lokalizace složek nad(P)H oxidázy gp91-phox a p22-phox v endotelových buňkách. Arterioskleróza, trombóza a vaskulární biologie, 20: 1903-1911.
27. Cobbs S, Malech HL, Leto TL, Freeman SM, Blaese RM, Gallin JI & Lomax kJ (1992). Retrovirová exprese rekombinantního proteinu p47phox pomocí B lymfocytů transformovaných virem Epstein-Barrové od pacienta s autosomálním chronickým granulomatózním onemocněním. Blood, 79: 1829-1835.
28. Gorlach A, Brandes RP, Nguyen K, Amidi M, Dehghani F & Busse R (2000). A gp91phox obsahující NADPH oxidázy selektivně vyjádřené v endotelových buňkách je hlavním zdrojem kyslíku radikální generace v arteriální stěně. Výzkum Oběhu, 87: 26-32.
29. Rouzaut A, Lopez-Moratalla N & de Miguel C (2000). Diferenciální genová exprese při aktivaci a zrání lidských monocytů. Archivy biochemie a biofyziky, 374: 153-160.
31. Ochs HD & Igo RP (1973). NBT slide test: jednoduchá screeningová metoda pro detekci chronických granulomatózních onemocnění a nosičů žen. Journal of Pediatrics, 83: 77-82.
32. Boyum A (1968). Izolace mononukleárních buněk a granulocytů z lidské krve. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation, 21 (Suppl 97): 1-77.
33. Condino-Neto A, Muscara MN, Grumach AS, Carneiro-Sampaio MMS & de Nucci G (1993). Neutrofily a mononukleární buňky od pacientů s chronickým granulomatózním onemocněním uvolňují oxid dusnatý. British Journal of Clinical Pharmacology, 35: 485-490.
35. Condino-Neto A, Muscara MN, Grumach AS, Bellinati-Pires R, Brandao AC, Carneiro-Sampaio MMS & de Nucci G (1996). Účinek rekombinantní terapie lidským interferonem-Gama na uvolňování neutrofilů a mononukleárních buněk oxidu dusnatého u pacientů s chronickým granulomatózním onemocněním. Žurnál výzkumu interferonu a cytokinů, 16: 357-364.
36. Volkman DJ, Buescher ES, Gallin JI & Fauci AS (1984). B buněčné linie jako modely zděděných fagocytárních onemocnění: generace superoxidu u chronického granulomatózního onemocnění a granule u Chediak-Higashiho syndromu. Journal of Immunology, 133: 3006-3009.
37. Nilsson K, Klein G, Henle W & Henle G (1971). Vytvoření lymfoblastoidních buněčných linií z dospělé a fetální lidské lymfoidní tkáně a její závislost na EBV. Mezinárodní žurnál rakoviny, 8: 443-450.
39. Subrahmanyam YVBK, Baskaran N, Newburger PE & Weissman SM (1999). Modifikovaná metoda pro zobrazení 3 ‚ – end restrikčních fragmentů cDNA: molekulární profilování genové exprese v neutrofilech. Metody v enzymologii, 303: 272-297.
Poděkování
autoři poděkovat pacientům a jejich rodinám za účast a za jejich pomoc, a sestra Silvana Severino pro technickou pomoc. Autoři také děkují Prof. Peter Newburger, University of Massachusetts Medical School, za kritickou recenzi tohoto rukopisu.
korespondence a poznámky pod čarou