Vztah mezi dobu, po vasektomii a reprodukční schopnosti spermie získané epididymální aspirace

Abstrakt

POZADÍ: To není dobře definováno, zda uplynulý čas po vasektomie nemá žádný vliv na výsledek IVF–ICSI pomocí epididymálních spermií. Zpětně jsme analyzovali výsledky 151 ICSI cyklů, ve kterých byly spermie vasektomizovaných mužů použity v různých časových obdobích po vasektomii. Metody: oocyty byly získány po desenzibilizujícím protokolu stimulace vaječníků pomocí agonisty GnRH ve spojení s rekombinantním FSH a HCG. Spermie byly získány perkutánní aspirací epididymálních spermií. Cykly byly rozděleny do tří skupin: nejvýše 10 let po vasektomii (skupina 1, n = 47), 11-19 let po vasektomii (skupina 2, n = 79), a ≥20 let po vasektomii (skupina 3, n = 25). TEST: Jak se dalo očekávat, že průměrný věk mužů se lišily ve třech skupin (skupina 3 > skupina 2 > skupina 1) a průměrný věk žen byl také významně vyšší ve skupině 3 než ve skupinách 1 a 2, i když žádné rozdíly byly popsány mezi skupinami 2 a 3. Všechny ostatní laboratorní a klinické parametry byly ve třech skupinách Podobné. Míra pokračujícího těhotenství a implantace (34, 25, 8% a 22, 15, 6%) se významně snížila ze skupiny 1 na skupinu 3. UZAVŘENÍ: Míra těhotenství a implantace po ICSI se spermatem od vasektomizovaných mužů negativně koreluje s časovým intervalem od vasektomie, což nelze vysvětlit čistě stárnutím mužů nebo žen.

Úvod

ICSI je úspěšné asistované reprodukce technika, která byla vyvinuta původně pro zmírnění mužský faktor neplodnosti (Palermo et al., 1992; Van Steirteghem et al., 1993). Zdá se, že výsledky dosažené ejakulovaným spermatem nesouvisejí s koncentrací nebo morfologií spermií (Nagy et al., 1995a; Svalander et al., 1996). Prognóza je ohrožena pouze v těch případech, kdy nejsou nalezeny žádné pohyblivé spermie (Nagy et al., 1995a).

Epididymální a testikulární aspirace spermií jsou běžně používá k získání spermií v případech obstrukční a non-obstrukční azoospermie. Míry oplodnění jsou v těchto případech podobné těm, které byly získány spermatem z ejakulátu (Nagy et al., 1995b; Van Steirteghem et al., 1998). ICSI, proto se stala účinná alternativa k obnovení plodnosti v po vasektomii případy, v nichž reanastomosis selhal nebo časové rozpětí od vasektomie má za následek sekundární lokality epididymální obstrukce. Kromě toho může ICSI eliminovat negativní účinky na fertilitu protilátek proti spermiím, které se u těchto mužů často vyskytují (Heidenreich et al ., 1994). Ve většině obstrukčních případů, včetně post-vazektomizovaných mužů, je aspirace epididymálních spermií metodou volby k získání spermií (Craft et al., 1995). Aspirace tenkou jehlou, jako technika, je jednodušší a méně invazivní postup než mikrochirurgické intervence na nadvarlata nebo na varlata (Tournaye et al., 1998).

nedávné zprávy naznačují, že mužská plodnost klesá s věkem (Auroux, 1993). Již dříve však bylo zveřejněno, že u normálních zdravých mužů kvalita spermatu sama o sobě s časem významně neklesá (Fisch et al., 1996). Kromě toho se zdá, že výsledek ICSI nesouvisí s otcovským věkem (Spandorfer et al ., 1998).

na druhé straně byly u post-vasektomizovaných samců popsány časově související negativní účinky na kvalitu spermatu a fertilitu (Urry et al ., 1990). Byl hlášen vyšší výskyt protilátek proti spermiím a shlukování spermií spolu se snížením podílu pohyblivých spermií (Weiske, 2001).

vzhledem k výše uvedeným výhodám ICSI oproti reanastomóze je významná část obstrukčních azoospermických pacientů, kteří hledají léčbu ICSI, vazektomizovaní muži. Protože v současné době není známo, zda má období po vazektomii nějaký vliv na výsledek ICSI-IVF, analyzovali jsme vztah mezi časovým obdobím po vazektomii a reprodukční schopností spermií po ICSI.

Materiály a metody

Jsme retrospektivně analyzovali výsledky 151 ICSI cyklů provést z důvodu post-vasektomii obstrukční azoospermie, dokončené v průběhu období od června 1998 do června 2000. Pacienti byli rozděleni do tří skupin podle časového období po vazektomii. Interval od vasektomie byl zaokrouhlen na nejbližší dokončený rok od data vasektomie do doby ICSI. Všechny případy byly postoupeny do našeho centra, protože jako primární formu terapie zvolili ICSI před reanastomózou vas. Všechny případy podstoupily perkutánní epididymální aspiraci spermií (PESA) jako techniku k získání spermií. Skupina 1 sestávala ze 47 cyklů, kdy doba od vasektomie byla ≤10 let; skupina 2 zahrnovala 79 cyklů, kdy časové období od vasektomie bylo mezi 11 a 19 lety a skupina 3 zahrnovala 25 cyklů, kdy časové období od vasektomie ≥20 let.

Ovariální stimulace byla provedena pomocí kombinace GnRH agonistou (leuprolid acetát, Lupron®; Abbott Laboratórios do Brasil Ltda, Sao Paulo, Brazílie), dlouhý protokol a rekombinantní FSH (Gonal-F®; Serono Laboratorios, São Paulo, Brazílie). Vývoj folikulů byl sledován pravidelným měřením sérového estradiolu a vaginálního ultrazvuku. HCG 10 000 IU (Profasi®; Serono Laboratorios) byl podáván, pokud nejméně dva folikuly dosáhl průměr 18 mm a získání oocytů byla provedena ultrazvukem řízené transvaginální aspirace 34 h později.

aspirace epididymálních spermií

spermie byly získány PESA. 27,5 jehla byla zavedena do proximální části nadvarlete (obvykle se nachází v horním pólu varlete) a jemné sání byla provedena s 1 ml injekční stříkačky (B-D; Becton Dickinson Ind. Cirúrgicas Ltda, Curitiba, Brazílie). Aspirát byl umístěn do Petriho misky a byl propláchnut médiem IVF-50 (IVF Science Scandinavian, Göteborg, Švédsko). Vzorek byl hodnocen na přítomnost pohyblivých spermií. Pokud ve vzorku nebyla přítomna žádná pohyblivá spermie, opakovala se epididymální aspirace.

Embryologie laboratoř postupy

Oocyty získané v čistě folikulární tekutiny okamžitě poslali do přilehlé embryologické laboratoře, kde byly identifikovány pomocí mikroskopem na x 50 zvětšení. Po identifikaci byly oocyty umístěny do jedné kultivační misky (3260; Costar, Cambridge, MA, USA) s 1,0 ml 80 IU/ml hyaluronidázy (Hyase-1; IVF Vědy Skandinávské) po dobu 30 s a následně byly několikrát promyty v IVF-50 medium. Každý oocyt byl umístěn samostatně uvnitř jedné kapky 30 µl IVF-50 střední a pokryté lehký minerální olej (Ovoil 150; IVF Vědy Skandinávské) a inkubovány po dobu 2-4 h při 37°C v atmosféře s 5% CO2. Na konci inkubační doby byly buňky cumulus a corona radiata odstraněny plastovou pipetou o průměru 135 µm, připojenou k odizolování buněk (Mid Atlantic Diagnostics Inc., Medford, NJ, USA).

Jaderné splatnosti a ooplasmic kvality byly vyhodnoceny pomocí invertovaný světelný mikroskop (Nikon Diaphot Mikroskop®; Nikon Corporation, Tokyo, Japonsko) v ×200 ×400 zvětšení. Metaphase-II (MII) oocyty byly mikroinjektovány během 2-4 hodin po odběru. Metaphase I (MI) oocyty byly pozorovány pro extruzi prvního polárního těla v intervalech 4 h až 8 h po odběru a injekce byla provedena odpovídajícím způsobem. Metody injekce spermií byly dříve hlášeny (Abdelmassih et al ., 1996).

Po injekce spermie, oocyty byly inkubovány v 1 ml IVF-50 medium, které s minerální olej, pro 16-18 h. Oocyty byly pozorovány 16-18 h po ICSI na přítomnost nebo nepřítomnost pronuclei a polárních tělísek (Nagy et al., 1998a). Oplodnění bylo považováno za normální, když byly přítomny dvě jasně odlišné pronuklei. Pokud byl pozorován jediný pronukleus, bylo provedeno druhé hodnocení přibližně o 4 hodiny později. Když byla zjištěna přítomnost tří pronukleí, oocyt byl vyřazen.

Oocyty obsahující dvě pronuclei byly kultivovány samostatně v kapkách 30 µl IVF-50 střední pokryta s minerálním olejem v Petriho misce (3260; Costar) a byly vedeny až do převodu. Embrya byla pozorována po 42 hodinách (den 2) a 68 hodinách (den 3)po injekci a klasifikována podle kritérií navržených Staessenem (Staessen et al ., 1989). Podle počtu blastomer a relativního podílu anukleátových fragmentů přítomných v zona pellucida byla embrya zařazena do jedné ze čtyř kategorií: 1, vynikající (typ A), když ne anucleate fragment byl přítomen (6 – až 8-buněčném stadiu na den 3); 2, dobrý (typ B), když <20% embrya byla roztříštěná (6 – až 8-buněčném stadiu na den 3 nebo <6 buněk bez fragmentace); 3, spravedlivé (typ C), kdy relativní množství fragmentů byla mezi 20 a 50%; a 4, chudý (typ D), když >50% embryí bylo roztříštěné. Embrya s >50% fragmentací nebyla přenesena.

V době převodu, embryí byl vložen do 15 µl IVF-50 medium pomocí Edwards Wallace Katétr 23 cm (Simcare Manufacturing Ltd, Hythe, Kent, UK).

luteální fáze byla podpořena každodenní podávání 800 mg vaginální progesteron (Utrogestan®; Laboratoires Besins-Isvovesco, Paříž, Francie) a transdermic 100 µg estradiolu záplaty mění každý den (Estraderm TTS100®; Biogalênica Laboratório, São Paulo, Brazílie). Sérové hladiny β-HCG byly měřeny 12 dní po přenosu embrya.

Transvaginální ultrazvuk byla provedena u všech pacientů s vzestupně β-HCG titry; přítomnost a počet intrauterinní gestační váčky byly hodnoceny, stejně jako přítomnost fetální pól a srdeční činnosti. Těhotenství bylo sledováno porodníkem pacienta a konečný výsledek byl hlášen klinice jak porodníkem, tak pacientkou.

Statistické analýzy

jeden způsob, analýza rozptylu (ANOVA) a Kruskal–Wallis testy byly použity k porovnání znamená, že ženské a mužské věku, hnojení, rychlost, kvalitní embrya, počet embryí přenesených a dobu, po vasektomii. Analýza kontingenční tabulky a Fisherovy přesné testy byly použity k porovnání těhotenství, míry implantace a potratů.

Výsledky

nejdůležitější výsledky 151 cyklů zahrnutých do studie jsou uvedeny v Tabulce I. Průměrný věk mužů se zvýšil ze skupiny 1 až 3 a rozdíl mezi každou skupinou byl statisticky významný (P < 0.0001). Tím žena věk byl významně nižší u skupiny 1 ve srovnání se skupinami 2 a 3 ale nejsou odlišné ve skupině 2 ve srovnání se skupinou 3 (Tabulka I).

průměrný počet získaných a injikovaných oocytů a míra oplodnění byly ve všech třech skupinách Podobné. Kvalita embryí a počet přenesených embryí byly ve třech skupinách Podobné (tabulka I).

klinické těhotenství rychlost a průběžná míra otěhotnění významně koreluje s obdobím, o vasektomii (P < 0.05; χ2 testu pro trend), a delší dobu vasektomie byla spojena s menším počtem těhotenství (Tabulka I). Implantace sazba také snížila ze skupiny 1 až 3 a rozdíl mezi skupinami byl statisticky významný (P < 0.05, kontingenční tabulce analýzy a Fisherův exaktní test). Míra potratů vykazovala tendenci ke zvýšení ze skupiny 1 na 3, ale nedosáhla statistické významnosti mezi skupinami.

abychom vyloučili vliv věku žen na výsledky, analyzovali jsme údaje 84 ze 151 cyklů, do kterých byly zahrnuty pouze ženy ve věku ≤35 let. Výsledky, organizovaný stejným způsobem do tří skupin, jsou uvedeny v Tabulce II. Rozdíl v průměrné mužské věku tří skupin zůstal signifikantní (P < 0.0001), ale žena věk se významně nelišila mezi třemi skupinami. Počet injikovaných a oplodněných oocytů byl také ve třech skupinách podobný, stejně jako počet a kvalita embryí přenesených na pacienty. Míra pokračujícího těhotenství a implantace byla významně vyšší ve skupinách 1 a 2 ve srovnání se skupinou 3(Tabulka II).

Diskuse

Naše data potvrzují, že perkutánní epididymální aspirace spermií v kombinaci s ICSI je možnost úspěšné léčby pro zmírnění post-vasektomii neplodnosti. Technika získávání spermií je jednoduchá, provádí se s lokální anestezií a může být opakována bez zjevného poškození nadvarlete.

Důležitější je, že výsledky z naší studie naznačují, poprvé, negativní korelace mezi výsledky těhotenství z asistované fertilizace a časové rozpětí od vasektomie na léčbu. Rozdíl v míře těhotenství a implantace přetrvával i po korekci výsledků podle věku žen. Jediný evidentní klinické rozdíly zbývající byly průměrný věk mužů mezi skupinami a doby vasektomii. Vliv mužského věku na výsledky asistované reprodukce není dobře stanoven. Některé studie naznačují pokles plodnosti s postupující muž věk (Auroux, 1993), nicméně většina studií neprokázala korelace mezi stárnutím a reprodukční potenciál muže (Krause a Habermann, 2000). Také individuální sledování po dobu až 25 let neodhalilo žádné důležité změny (Fisch et al., 1996). Ještě důležitější je, pokud jde o naši studii, výsledky ICSI pro různé diagnostické kategorie nejsou ovlivněny věkem mužského partnera (Spandorfer et al ., 1998) na rozdíl od důležité role věku partnerky (Abdelmassih et al., 1996; Devroey a kol., 1996).

úspěšnost reverzace vasektomie při obnově plodnosti je inverzní vztah k časovému rozpětí z vasektomie (Belker et al., 1991). Až do teď, čas-související negativní dopady vasektomii ve vztahu k plodnosti byly přiřazeny mechanické faktory (zvyšující se výskyt sekundární lokality epididymální obstrukce), který dělal anatomické obnova obtížnější, a ke vzniku významné titry anti-spermií protilátek (Heidenreich et al., 1996). ICSI zjevně překonává mechanické zablokování a výsledky získané touto technikou jsou nezávislé na imunologických faktorech (Nagy et al ., 1995c).

všechny případy zahrnuté do naší studie podstoupily aspiraci epididymálních spermií. Silber et al. navrhli, že v případě chronicky ucpaný epididymis, spermie trpět změny týkající se stárnutí s významným snížení pohyblivosti směrem k distální části (Silber et al., 1995). Na druhé straně Moore uvedl, že v těchto případech se v proximální části nachází také nepřiměřený počet mrtvých nebo umírajících spermií (Moore, 1998). Autor naznačuje, že za normálních podmínek, epididymální tekutina chrání životaschopné spermie z akrozomálních enzymů osvobození tím, že spermie v procesu degenerace. Stagnace sekundární k chronické obstrukci by narušovala tento ochranný mechanismus. Navíc bylo prokázáno, že u mužů s obstrukční azoospermií je DNA testikulárních spermií významně méně poškozena než DNA proximálního epididymálního spermatu (Steele et al ., 1999). Ve stejné studii autoři zjistili, že kvality DNA spermií získaných z varlat je stejný jako, že našel v normální muži, což naznačuje, že poškození objevené v epididymálních spermií se získává s časem poté, co byl vyroben. Je lákavé spekulovat, že poškození DNA epididymálních spermií se zvyšuje s časem obstrukce a v zde uvedených případech časem z vasektomie. Ve stejné linii myšlení, použití nepohyblivé (vzhledem k necrozoospermia) ejakuloval nebo epididymálních spermií pro ICSI byla spojena s velmi špatnou fertilizace a embryonálního vývoje; nicméně, testikulární spermie (od stejného pacienta), i když immotile, poskytly mnohem lepší výsledek léčebného cyklu (Nagy et al., 1995a; Tournaye et al., 1996; Nagy a kol., 1998b).

V této studii nebyly pozorovány významné rozdíly v hnojení rychlost a kvalitu embrya přenesena na 72 h po oplodnění mezi třemi skupinami. Účinky pomocí molekulárně poškozené spermie na oplodnění by mohly být maskovány s použitím ICSI, a v raných fázích vývoje embrya závisí především na mateřské informace jako embryonálního genomu je aktivován po 8-buněčné stádium (Braude et al., 1988). Nicméně, zvýšené poškození DNA epididymálních spermií (používá výhradně v případech, které uvádí), může představovat vysvětlení pro nižší implantaci embrya sazby a pro vyšší míru potratu našel v případech s delší dobou od vasektomii.

naše výsledky se liší od údajů uváděných ostatními (Sukcharoen et al., 2000), ale nemusí být v přímém rozporu. Počet případů zahrnutých do naší studie byl významně větší a dříve hlášené údaje zahrnovaly některé případy, kdy byl ICSI proveden se spermatem získaným z varlat.

zde uvedené nálezy mohou mít významné klinické důsledky. Perkutánní aspirace epididymálních spermií je jednoduchý, rychlý a populární postup pro získání spermií od mužů s obstrukční azoospermií; ve světle této studie však může aspirace jemnou jehlou z varlat představovat lepší přístup, zejména v případech s prodlouženou dobou obstrukce. Je však třeba provést další sběr a analýzu údajů získaných z prospektivních studií, aby se v těchto případech stanovil nejlepší zásah.