Grill J Med Biol Res, maj 2004, volumen 37(5) 625-634
anvendelse af revers transkription-PCR til diagnosticering af kronisk granulomatøs sygdom
P. Agudelo-FL-P. 1, J. A. L-P. 1, J. Redher1, M. M. S. Carneiro-Sampaio2, B. T. Costa-Carvalho3, A. S. Grumach4 og A. Condino-Neto1
1centro de investiga Larso em pediatria, og institutterne for pædiatri og farmakologi, det medicinske fakultet, State University of Campinas, Campinas, SP, Brasilien
2departamento for Immunologi, Institut for Biomedicinske Videnskaber, Universidade de S Larso Paulo, s Larso Paulo, SP, Brasilien.
3disciplina of Allergy, Immunology and Rheumatology, Institut for pædiatri, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de S Kurto Paulo, s Kurto Paulo, SP, Brasilien.
4laborat larrio medicinsk forskning 56, Institut for dermatologi, det medicinske fakultet,, Universidade de S Kurto Paulo, s Kurto Paulo, SP, Brasil
abstrakt
introduktion patienter og metoder resultater Diskussion anerkendelser
korrespondance og fodnoter
abstrakt
kronisk granulomatøs sygdom (CGD) er en arvelig lidelse i det medfødte immunsystem, der er kendetegnet ved en defekt iltning af fagocytter og efterfølgende svækkelse af deres mikrobicide aktivitet. Mutationer i en af NADPH-oksidasekomponenterne påvirker genekspression eller funktion af dette system, hvilket fører til fænotypen af CGD. Fejl i gp91 fører til CGD, der er ansvarlig for ca.70% af CGD-tilfældene. Undersøgelse af den meget heterogene genotype af CGD-patienter inkluderer mutationsanalyse, Northern blot eller vestlige blot assays i henhold til det særlige tilfælde. Formålet med denne undersøgelse var at anvende revers transkription (RT)-PCR til analyse af molekylære defekter, der er ansvarlige for KSB-forbundet CGD hos otte Brasilianske patienter og at vurdere dets potentiale for bredere anvendelse til molekylær screening i CGD. Total RNA blev fremstillet ud fra Epstein B-virustransformerede B-lymfocytter og revers transkriberet under anvendelse af tilfældige heksamere. Det resulterende cDNA blev PCR-forstærket af specifikke og overlappende par primere designet til at amplificere tre regioner i gp91-phoksgenet: eksoner 1-5, 3-9 og 7-13. Denne strategi detekterede defekt gp91-phoks-ekspression hos syv patienter. RT-PCR-resultaterne matchede klinisk historie, biokemiske data (nitroblue tetrasolium eller superkilte-frigivelsesassay) og tilgængelig mutationsanalyse i fire tilfælde. I yderligere tre tilfælde matchede RT-PCR-resultater klinisk historie og biokemiske data. I et andet tilfælde var RT-PCR normal på trods af en klinisk historie kompatibel med CGD og defekt respiratorisk burst. Vi konkluderer, at denne nye anvendelse af RT-PCR-analyse-en enkel, økonomisk og hurtig metode – var passende til screening af molekylære defekter hos 7 ud af 8 CGD-patienter.
nøgleord: Superkilte, fagocytter, primær immundefekt, respiratorisk burst, neutrofiler, Human
introduktion
kronisk granulomatøs sygdom (CGD) er en primær immundefekt, der oprindeligt blev beskrevet i 1957 som en klinisk enhed, der påvirker mandlige spædbørn og på det tidspunkt navngivet dødelig granulomatøs sygdom i barndommen. De vigtigste egenskaber ved CGD er tilbagevendende og alvorlige infektioner, der involverer organismens naturlige barrierer, såsom luftvejene og lymfeknuder, og til sidst indre strukturer såsom lever, milt, knogler og hjerne (1-3). Den estimerede forekomst af denne sjældne sygdom er 1/250.000 levende fødsler om året. Infektionerne er generelt forårsaget af katalase-negative bakterier såsom Staphylococcus aureus, Gram-negative baciller og svampearter såsom Aspergillus, Candida og Nocardia (4,5).
NADPH-oksidasesystemet genererer superilte og andre reaktive iltmellemprodukter, der er afgørende for fagocytternes mikrobicide aktivitet. Den biokemiske defekt i CGD er en svækkelse af NADPH-oksidaseaktivitet og efterfølgende manglende evne til at ødelægge mikroorganismer (6). De vigtigste komponenter i NADPH-systemet er gp91-, p22-, p47-, p67-og p40-phoks. Molekylære defekter, der forårsager CGD, skyldes generelt fravær, lav ekspression eller funktionsfejl i en af NADPH-oksidasekomponenterne. Denne sygdom er forårsaget af defekter i gp91-phoks, den tunge kæde af cytokrom b588, og tegner sig for cirka 70% af alle tilfælde (7,8). Autosomale recessive former er forårsaget af defekter i en af de cytosoliske komponenter NADPHOKSIDASE (p47 – eller p67-phoks henholdsvis 20 og 5% af tilfældene) eller cytochrom b588 lyskædekomponent (p22-phoks, 5% af tilfældene) (9,10). CGD er en meget heterogen tilstand: over 300 mutationer er blevet registreret i en internationalt vedligeholdt CGD-database (8). Mutationerne er stort set fordelt inden for de 13 eksoner eller ved ekson/intron-grænserne for gp91-phoks (CYBB) – genet, og næsten 200 af disse mutationer er unikke.
diagnosen CGD er generelt baseret på sygdommens kliniske egenskaber plus defekt NADPH-oksidaseaktivitet som påvist ved unormal nitroblue tetrasolium (NBT), dihydrorhodamin 123 eller superkilte-frigivelsesassays (11,12). I den stimulerede NBT-test viser normale individer næsten 100% positive celler, mens hos CGD-patienter er færre end 5% af cellerne positive (13). Derudover er celler fra patienter med variant CGD positive, men viser kun meget lav aktivitet (6). NBT-testen registrerer også bærerne af CGD (mødre og søstre). En endelig molekylær CGD-diagnose er etableret hos patienter med en unormal NBT-test eller respiratorisk burst-aktivitet, der har en af følgende egenskaber: en mutation i gp91 -, p22 -, p47-eller p67-phoks; fraværende mRNA for et af disse gener påvist ved Northern blot-analyse; og/eller fraværende protein for en af disse oksidasekomponenter ved vestlig blot. En genetisk, men ikke molekylær diagnose kan etableres ved demonstration af moderens fætre, onkler eller nevøer med en unormal NBT-test eller respiratorisk burst (14). Etableringen af en endelig diagnose af denne sjældne og meget heterogene sygdom kræver således komplekse og dyre metoder såsom en kombination af Northern blot eller vestlig blot og enkeltstrenget konformationspolymorfismanalyse (SSCP) efterfulgt af DNA-sekventering af flere familiemedlemmer, alle udført i forskningslaboratorier med høj kompleksitet.
den omvendte transkription-PCR (RT-PCR) metode involverer amplifikation af cDNA ved PCR. Denne teknik kan let standardiseres i mindre sofistikerede laboratorier. Det giver information om genekspression og foreløbige data om strukturen eller størrelsen af mRNA ‘ et for den defekte komponent. RT-PCR er sjældent blevet brugt i CGD-forskning, idet den er begrænset til patofysiologiske undersøgelser (15-29). Til dato er den potentielle anvendelse af dette nyttige værktøj til etablering af den endelige diagnose af KS-forbundet CGD, den hyppigste form, ikke blevet grundigt undersøgt. Formålet med denne undersøgelse var at evaluere brugen af RT-PCR til screening af molekylære defekter, der er ansvarlige for Ksbundet CGD, en sjælden og muligvis fejldiagnosticeret immundefekt, hos otte Brasilianske patienter.
patienter og metoder
patienter
undersøgelsen omfattede 8 ikke-relaterede mandlige Brasilianske patienter med sandsynlig KS-forbundet CGD (2 sorte og 6 kaukasiere; alder 2-8 år; højde 88-108 cm; Vægt 11-19 kg). Patienterne præsenterede kliniske historier med tilbagevendende alvorlige infektioner såsom lungebetændelse, lymfadenitis, leverabces, pyodermitis og bivirkninger på BCG-immunisering. De blev henvist til vores laboratorium for biokemisk og molekylær diagnostisk evaluering. Der blev indhentet skriftligt informeret samtykke fra deltagerne inden undersøgelsen. Det medicinske skoles etiske udvalg godkendte protokollen i overensstemmelse med Helsingfors-konventionen og det brasilianske sundhedsministerium, Resolution 196/96.
biokemisk diagnose af CGD
den biokemiske diagnose af CGD blev etableret i henhold til den panamerikanske gruppe for Immundefektkriterier. Ved NBT-diasetesten og/eller analysen af frigivelse af anion af perifere blodneutrofiler og mononukleære leukocytter (14,30,31) blev der påvist en svækkelse af NADPH-oksidaseaktiviteten. Neutrofiler og mononukleære leukocytter blev opnået ved centrifugering af blodprøver over en Ficoll-Hypak densitetsgradient (32).
NBT-diasprøven var baseret på reduktion af NBT til formasan med aktiverede leukocytter (31). Analysen blev udført som tidligere beskrevet (30). Mere end 95% af 200 normale neutrofiler stimuleret med 30 nM phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) skal være i stand til at reducere NBT. Manglende reaktion eller < 5% positive celler blev anset for at indikere en diagnose af CGD (14).
kvantitativ frigivelse af superkilte fra neutrofiler og mononukleære leukocytter blev vurderet ved en modificeret superkilte-dismutasehæmmende cytochrom C-reduktionsassay (33-35). Mængden af frigivet superilte blev beregnet ved hjælp af en udryddelseskoefficient på 0,21 nM/cm for cytokrom c. resultaterne rapporteres som nmol superilte frigivet af 106 celler i timen. Patienter med CGD viste mindre end 10% af kontrolværdierne.
Screening af molekylære defekter, der er ansvarlige for Ksbundet CGD
B-lymfocytter fra Ksbundne CGD-patienter, blev transformeret in vitro med Epstein B-virus (EBV) (15,16) for at tilvejebringe en rigelig kilde til nukleinsyrer til molekylære undersøgelser. De EBV-transformerede B-cellelinjer reproducerer de biokemiske og molekylære defekter hos CGD-patienter (15,16,36) og eliminerer behovet for gentagne blodsamlinger. Kort fortalt blev perifere blodleukocytter dyrket med supernatanter fra B95-8, en EBV-producentcellelinie (15,16,36,37), i rpmi 1640-medium suppleret med varmeinaktiveret føtalt bovint serum (10%), 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penicillin og 100 liter/ml streptomycin ved 37 liter i en fugtig atmosfære med 5% CO2. Cellelevedygtigheden blev overvåget, og kulturerne blev opretholdt i hele undersøgelsesperioden.
RNA-prøver fra EBV-transformerede B-cellelinjer blev fremstillet ved guanidin HCl-metoden efterfulgt af ethanoludfældning og kvantificering ved standardmetoder (38,39). CDNA-prøverne blev opnået ved revers transkription af 2 liter Total RNA med SuperScript II RT (GIBCO BRL) og tilfældige sekskamre (15). Kvaliteten af mRNA-prøverne blev kontrolleret ved PCR-amplifikation af Kurt-actin, en konstitutiv genkontrol (bp 920-943 og bp 1494-1471) (gen Banktiltrædelsesnr. NM001101).
gp91-genekspression blev vurderet ved RT-PCR. Specifikke og overlappende par primere (gen Bank tiltrædelse nr. NM_000397, tabel 1) blev anvendt til at forstærke (30 cyklusser) tre gp91-eksoniske regioner: 1-5, 3-9 og 7-13. Denne strategi tillod os at screene alle gp91-eksoner. PCR-produkter blev analyseret med 2% agarosegelelektroforese og farvet med ethidiumbromid.
relativ gp91-phoks-genekspression blev analyseret med Billedmesterprogrammet (Pharmacia-Biotech). Densitometri-resultatet for målprøver blev divideret med densitometri-resultatet af Kurt-actin, en konstitutiv genkontrol, normalisering af det niveau, der overvejes til analyse. Resultaterne af RT-PCR-assays blev sammenlignet med patientens kliniske historie, biokemiske assays (NBT-og/eller superkildefrigivelsesassay) og tilgængelige mutationsanalysedata (http://www.sbi.org.br/Sbi2003/ indeks.htm).
resultater
vi studerede 8 mandlige patienter med kliniske historier med tilbagevendende alvorlige infektioner, henvist til vores laboratorium til biokemisk og molekylær diagnose af CGD. Resultaterne af NBT-diasprøvningerne og analyserne for frigivelse af superkilte er vist i tabel 2. Seks af patienterne præsenterede mindre end 5% positive leukocytter i NBT-glidetesten. Seks patienter viste nedsat frigivelse af superkilte med granulocytter og / eller mononukleære leukocytter (mindre end 10% sammenlignet med sunde kontroller). Fire patienter havde unormale resultater i begge test. Alle patienter præsenterede mindst en unormal test og modtog diagnosen sandsynlig Røntgenforbundet CGD. Moderen og søsteren til patient T. B. P. præsenterede en NBT-slide-test, der var Kompatibel med bærestatus for CGD. I undersøgelsesperioden døde en patient (G. M.) af lungebetændelse.
vi undersøgte derefter den endelige diagnose af CGD ved RT-PCR-analyse af gp91-phoks-genekspression. Resultaterne af RT-PCR-amplifikation med tre sæt overlappende primere er vist i tabel 2. Kvaliteten af mRNA-prøven blev kontrolleret ved PCR-amplifikation af purpur-actin, en konstitutiv genkontrol. De forventede normale produkter blev opnået i dette tilfælde (Figur 1, 2 og 3).
i fire tilfælde var det muligt at matche RT-PCR-data med tilgængelig mutationsanalyse, præsenteret andre steder af Pati Reno et al. (30) eller af vores gruppe ( //www.sbi.org.br/Sbi2003/index.htm): J. E. M. præsenterede en c469-t-overgang i ekson 5 og forudsagde en nonsensmutation (R157H). M. F. præsenterede en nonsens substitution i ekson 3, R (arginin) 73-Stop. R. S. viste en 264 g KP en substitution ved 3 ‘ splejsningskrydset af gp91-ekson 3. CDNA-sekvensen viste en sletning af gp91-phoks ekson 3, hvilket gav anledning til en ustabil eller ikke-funktionel mutant gp91-phoks. G. G. præsenteret en defekt splejsning af gp91-phoks ekson 3 (den underliggende mutation er endnu ikke bestemt). De andre patienter undersøges fortsat.
som helhed tillod denne strategi påvisning af defekt gp91-phoks-ekspression hos syv ud af otte patienter. RT-PCR-resultaterne matchede klinisk historie, biokemiske data (NBT-eller superkildefrigivelsesassay) og tilgængelig mutationsanalyse i fire tilfælde. I yderligere tre tilfælde matchede RT-PCR-resultater klinisk historie og biokemiske data. I et andet tilfælde var RT-PCR normalt på trods af en klinisk historie, der var Kompatibel med CGD, en defekt respiratorisk burst, der var kendetegnet ved NBT-test og superkilte-frigivelsesassay og NBT-test af sin mor og søster, der var Kompatibel med CGD-bærerstatus.
Diskussion
dette papir rapporterer om biokemiske og genekspressionsundersøgelser af 8 ikke-relaterede Brasilianske mandlige patienter med en klinisk historie med CGD, som blev henvist til vores laboratorium for detaljeret undersøgelse. CGD er en sjælden arvelig lidelse, hvor fagocytiske celler ikke er i stand til at generere superokteanion og andre reaktive iltmellemprodukter. Vi etablerede oprindeligt diagnosen sandsynlig Røntgenforbundet CGD ved hjælp af biokemiske metoder såsom NBT-glidetest og/eller assays om frigivelse af anion. Vores resultater viste, at alle patienter præsenterede nedsat NADPH-oksidasefunktion og til gengæld sandsynlig Røntgenforbundet CGD.
begge metoder bidrager til den sandsynlige diagnose af CGD på forskellige måder. NBT-glidetesten giver information om antallet af celler, der reducerer NBT til formasan inde i cytoplasmaet og intensiteten af denne reduktion. Patienter med variantformer af CGD viser således unormale NBT-diasforsøg, hvor de fleste af cellerne svagt reducerer NBT til formasan. NBT-glidetesten registrerer også kvindelige bærere af CGD. Det er vigtigt at vide, at det er muligt at foretage en diagnose af cytokrom C ved hjælp af aktive leukocytter, der er til stede i reaktionen, hvilket gør det muligt at diagnosticere variantformer af røntgenbundet CGD. Begge tests kan let standardiseres i laboratorier med lav kompleksitet og kræver heller ikke dyrt udstyr. Dihydrorhodamine 123-testen er en meget følsom metode til biokemisk diagnose af CGD; det kræver dog et strømningscytometer, et meget dyrt instrument.
vi evaluerede gp91-genekspression i EBV-transformerede B-lymfocytter fra CGD-patienter ved RT-PCR-analyse. Specifikke og overlappende par primere blev brugt til at amplificere tre regioner af gp91-phoks genet ved RT-PCR: eksoner 1-5, 3-9 og 7-13. Denne strategi tillod påvisning af defekt gp91-phoks-ekspression hos 7 ud af 8 patienter. RT-PCR-resultaterne matchede klinisk historie, biokemiske data (NBT-eller superkildefrigivelsesassay) og tilgængelig mutationsanalyse i fire tilfælde. I yderligere tre tilfælde matchede RT-PCR-resultater klinisk historie og biokemiske data.
gp91-genekspression blev reduceret i alle eksoniske regioner af patient R. B. denne reduktion kan være resultatet af mutationer, der fører til lav RNA-stabilitet eller ændret transkriptionel aktivitet. Patienter G. M. Og T. P. 7-13, hvilket antyder, at den nedsatte ekspression af disse yderligere 3′-end-eksoner kan være resultatet af RNA-ustabilitet eller en splejsningsdefekt, f.eks. delvist korrekt splejsning for at producere et signal, men delvist unormal splejsning for at eliminere et primerbindingssted, et emne, der skal undersøges ved fremtidige genomiske DNA-mutationsanalyser.
Patient G. G. præsenterede en diffus, lav overflod, mindre størrelse produkt af eksoner 1-5 (Figur 1) og fraværende ekspression af andre eksoniske regioner. Hans mutationsanalyse viste en defekt på splejsningsstedet ekson 3. Tilsvarende afslørede mutationsanalysen af patient R. S. også en defekt på ekson 3 splejsningsstedet. I dette tilfælde kunne der imidlertid påvises et mindre rigeligt PCR-produkt.
Patient M. F. præsenterede reduceret ekspression af eksoniske regioner 3-9 og 7-13, hvilket kan være resultatet af defekt transkriptionsaktivitet i ekson 3. J. E. M. præsenterede en nonsensmutation i ekson 5, der resulterede i tab af gp91-phoks-ekspression, som det fremgår af RT-PCR-analyse, en mulig konsekvens af nonsens-medieret mRNA-ustabilitet.
i et tilfælde, patient T. P. B., gp91 – genekspression var normal på trods af en familiehistorie kompatibel med CGD og en defekt respiratorisk burstaktivitet. I dette tilfælde var diagnosen sandsynlig Røntgenforbundet CGD baseret på unormale NBT-tests hos hans mor og hans søster, kompatibel med bærerstatus. Vi antager, at en punktmutation, såsom en enkelt basesubstitution, der ikke ændrer PCR-fragmentlængde eller overflod, bør undersøges i dette særlige tilfælde.
RT-PCR er et kraftfuldt værktøj til at vurdere genekspression. Denne egenskab kan delvist forklare variabiliteten af gp91-phoks-genekspression blandt de patienter, der er inkluderet i denne undersøgelse, og vigtigheden af at kombinere overlappende par primere for at screene meddelelsens fulde længde. RT-PCR er blevet anvendt i isolerede casestudier som en del af den indledende diagnose af de forskellige former for CGD (17-22). RT-PCR-analyse var også nyttig i prænatal diagnose af CGD, som følge af P47-phoks-mangel (23). Det har imidlertid været mere almindeligt anvendt til undersøgelse af genregulering af NADPH-oksidasekomponenterne i en række celler (15,16,24-29). Hidtil er den potentielle anvendelse af dette nyttige værktøj til etablering af den endelige diagnose af KS-forbundet CGD, den hyppigste form, ikke blevet undersøgt grundigt. Yderligere undersøgelser skal udføres for at sammenligne følsomheden og specificiteten af denne test sammenlignet med andre komplekse assays såsom vestlige eller nordlige blots.
samlet set har vi demonstreret, at RT-PCR, en enkel og billig metode, etablerede den endelige diagnose af KS-forbundet CGD i 7 ud af 8 tilfælde uden behov for at bruge komplekse og dyre metoder såsom Northern blot, slot blot, SSCP-analyse eller genomisk DNA-sekventering. Således kan RT-PCR være et egnet værktøj til diagnosticering af CGD i laboratorier i udviklingslande. Det er meget vigtigt at bestemme den endelige molekylære genetiske defekt for at give den passende genetiske rådgivning og prognose til slægtninge med CGD. Derudover vil molekylære genetiske undersøgelser af det humane NADPH-oksidasesystem fremme viden om denne afgørende og gamle forsvarsmekanisme.
2. Landing BH & Shirkey HS (1957). Et syndrom af tilbagevendende infektion og infiltration af indvolde af pigmenterede lipid histiocytter. Pædiatri, 20: 431-442.
3. Patterson EL, Milstrey R & Stokstad ELR (1975). Virkning af selen til forebyggelse af eksudativ diatese hos kyllinger. Forløbet af Society for eksperimentel biologi og medicin, 95: 617-620.
5. Forrest CB, Forehand JR, Akstell RA, Roberts RL & Johnston Jr RB (1988). Kliniske træk og nuværende styring af kronisk granulomatøs sygdom. Hæmatologi / onkologi klinikker i Nordamerika, 2: 253-266.
6. Curnutte JT (1993). Kronisk granulomatøs sygdom: løsningen af en klinisk Gåde på molekylært niveau. Klinisk Immunologi og immunopatologi, 67: S2-S15.
7. Dinauer MC, Orkin SH, brun R, Jesaitis aj & Parkos CA (1987). Det er en af de mest almindelige årsager til kronisk granulomatøs sygdom. Natur, 327: 717-720.
9. Clark RA, Malech HL, Gallin JI, Nunoi H, Volpp BD, Pearson DV, kvalme & Curnutte JT (1989). Genetiske varianter af kronisk granulomatøs sygdom: forekomsten af mangler ved to cytosoliske komponenter i NADPH-oksidasesystemet. Ny England Journal of Medicine, 321: 647-652.
10. Cross AR, Noack D, Rae J, Curnutte JT & høg PG (2000). Hæmatologisk vigtige mutationer: de autosomale recessive former for kronisk granulomatøs sygdom (første opdatering). Blodceller, molekyler og sygdomme, 26: 561-565.
11. Smith RM & Curnutte JT (1991). Molekylært grundlag for kronisk granulomatøs sygdom. Blod, 77: 673-686.
12. H. C. S. S., H. C. S., H. C. S., Maguire TE & Malech HL (1996). Genotypeafhængig variabilitet i strømningscytometrisk evaluering af reduceret nicotinamidadenindinukleotidphosphatoksidasefunktion hos patienter med kronisk granulomatøs sygdom. Tidsskrift for pædiatri, 128: 104-107.
15. Condino-Neto a & NYBURGER PE (1998). B558 – indholdet af humane Epstein-Barr-virustransformerede B-lymfocytter korrelerer med ekspression af gener, der koder for komponenter i oksidasesystemet. Arkiv for Biokemi og Biofysik, 360: 158-164.
16. Condino-Neto a & NYBURGER PE (2000). Interferon-gamma forbedrer splejsningseffektiviteten af CYBB-gentranskripter i en interferon-responsiv variant af røntgenbundet kronisk granulomatøs sygdom på grund af en Splice site konsensus Region mutation. Blod, 95: 3548-3554.
19. A, Russo MP, Donini M &Dusi S (1997). Identifikation af en dobbelt mutation (D160V-K161E) i p67phoks genet af en kronisk granulomatøs sygdom patient. Biokemisk og biofysisk forskningskommunikation, 231: 861-863.
21. Noack D, PG, NYBURGER PE & kryds AR (2001). En usædvanlig intronisk mutation i CYBB-genet, der giver anledning til kronisk granulomatøs sygdom. Biochimica et Biophysica Acta, 1537: 125-131.
22. Roesler J, Curnutte JT, Rae J, Barrett D, Patino P, Chanock SJ & Goerlach A (2000). Rekombinationshændelser mellem P47-phoks-genet og dets meget homologe pseudogener er hovedårsagen til autosomal recessiv kronisk granulomatøs sygdom. Blod, 95: 2150-2156.
23. De Boer M, Singh V, Dekker J, Di Rocco M, Goldblatt D & Roos D (2002). Prænatal diagnose i to familier med autosomal, P47 (phoks)-mangelfuld kronisk granulomatøs sygdom på grund af en ny punktmutation i NCF1. Prænatal Diagnose, 22: 235-240.
24. Baehner RL, Millar-Groff s & Bringas P (1999). Udviklingsmæssig ekspression af NADPH fagocytiske oksidasekomponenter i musembryoer. Pædiatrisk Forskning, 46: 152-157.
25. Banerjee R, Anguita J, Roos D & Fikrig E (2000). Forkant: infektion af midlet af human granulocytisk ehrlichiosis forhindrer respiratorisk burst ved nedregulerende gp91phoks. Tidsskrift for Immunologi, 164: 3946-3949.
26. Bayraktutan U, Blayney L & Shah AM (2000). Molekylær karakterisering og lokalisering af nad(P)H-komponenter gp91-phoks og p22-phoks i endotelceller. Arteriosklerose, trombose og vaskulær biologi, 20: 1903-1911.
27. Cobbs S, Malech HL, Leto TL, Freeman SM, Blaese RM, Gallin JI & Lomaks KJ (1992). Retroviral ekspression af rekombinant p47phoks-protein af Epstein-Barr-virustransformerede B-lymfocytter fra en patient med autosomal kronisk granulomatøs sygdom. Blod, 79: 1829-1835.
28. Gorlach A, Brandes RP, Nguyen K, Amidi M, Dehghani F & Busse R (2000). En gp91phoks indeholdende NADPH oksidase selektivt udtrykt i endotelceller er en vigtig kilde til ilt radikal generation i arterievæggen. Cirkulationsforskning, 87: 26-32.
29. A, Lopes-Moratalla N & de Miguel C (2000). Differentiel genekspression i aktivering og modning af humane monocytter. Arkiv for Biokemi og Biofysik, 374: 153-160.
31. Ochs HD & Igo RP (1973). NBT-glidetesten: en simpel screeningsmetode til påvisning af kronisk granulomatøs sygdom og kvindelige bærere. Tidsskrift for pædiatri, 83: 77-82.
32. Boyum A (1968). Isolering af mononukleære celler og granulocytter fra humant blod. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation, 21 (Suppl 97): 1-77.
33. Condino-Neto A, Muscara MN, Grumach AS, Carneiro-Sampaio MMS & de Nucci G (1993). Neutrofiler og mononukleære celler fra patienter med kronisk granulomatøs sygdom frigiver salpetersyre. British Journal of Clinical Pharmacology, 35: 485-490.
35. Condino-Neto a, Muscara MN, Grumach AS, Bellinati-Pires R, Brandao AC, Carneiro-Sampaio MMS & de Nucci G (1996). Virkningen af rekombinant human interferon-gamma terapi på neutrofil og mononuklear celle salpetersyre frigivelse fra patienter med kronisk granulomatøs sygdom. Tidsskrift for Interferon og Cytokinforskning, 16: 357-364.
36. Volkman DJ, Buescher ES, Gallin JI & Fauci AS (1984). B-cellelinjer som modeller for arvelige fagocytiske sygdomme: generering af superkilte ved kronisk granulomatøs sygdom og granulat ved Chediak-Higashi-syndrom. Tidsskrift for Immunologi, 133: 3006-3009.
37. Nilsson K, Klein G, Henle M & Henle G (1971). Etablering af lymfoblastoide cellelinjer fra voksne og føtale humane lymfoide væv og dets afhængighed af EBV. International Journal of Cancer, 8: 443-450.
39. Subrahmanyam YVBK, Baskaran N, NYBURGER PE & Viissman SM (1999). En modificeret metode til visning af 3′-end restriktionsfragmenter af cDNA ‘ er: molekylær profilering af genekspression i neutrofiler. Metoder i Ensymologi, 303: 272-297.
anerkendelser
forfatterne takker patienterne og deres familier for at have deltaget og for deres hjælp, og sygeplejersken Silvana Severino for teknisk assistance. Forfatterne takker også professor Peter Nyburger, University of Massachusetts Medical School, for en kritisk gennemgang af dette manuskript.
korrespondance og fodnoter