ELISA: hvordan man analyserer eksperimentelle resultater

af Dr. Surat P, Ph. D. gennemgået af Dr. Tomislav me Prittrovi, MD, Ph. D.

ELISA, eller immunosorbentassay, er et værktøj, der bruges til at detektere og kvantificere stoffer, såsom peptider, proteiner, antistoffer og hormoner. Det involverer immobilisering af et antigen eller antistof på en overflade efterfulgt af tilsætning af en prøve, der skal analyseres. Påvisning er afhængig af en specifik antigen-antistofreaktion.

Jarun Ontakrai |

Hvad skal man gøre, før man kører en ELISA

en ELISA-test skal altid udføres i replikater (duplikater eller triplicater) for at opnå tilstrækkeligt antal prøver til at beregne standardafvigelsen og koefficienten af variation. Fejlkoefficienten bør opretholdes mindre end 20%. Hvis den beregnede fejl er høj, skal fejl, der opstår på grund af pipettering, forurening af plader og reagenser, fordampning og/eller temperatur, vurderes.

standardkurve

en standardkurve bruges til at måle koncentrationen af prøven. For det første afbildes absorbansværdierne for standardkoncentrationer (pg/ml). En negativ kurve udføres også, som ikke indeholder nogen standardeksempeldata og bruges til at registrere og måle baggrundsstøj. For en nøjagtig måling skal denne baggrundsværdi trækkes fra standardkurven.

absorbansværdierne for kendt koncentration kan afbildes som en positiv kontrol. Koncentrationen af målproteinet udledes ved først at beregne den gennemsnitlige absorbans og derefter bruge standardkurven til at estimere koncentrationen.

Fortyndingsfaktorer bør også tages i betragtning. For eksempel, hvis prøven er blevet fortyndet fire gange, skal absorbansen ganges med fire, inden standardkurven anvendes til at udlede koncentrationen.

variationskoefficient

definitionen af variationskoefficient er forholdet mellem standardafvigelse og middelværdi – dvs.standardafvigelse (kurr)/middelværdi (kurr). Store værdier af variationskoefficient indikerer unøjagtigheder på grund af pipettering eller blanding af reagenser mellem brønde, bakterie-eller svampekontaminering, udtørring af brønde eller temperaturvariationer.

Spike recovery

værdien opnået efter kørsel af ELISA-testen afhænger af, hvordan et målrettet protein interagerer med antistofferne, og denne interaktion sammenlignes med en standardproteinkurve. Flere faktorer-herunder buffer, Matrice og heterofile antistoffer – kan påvirke bindingen af prøven, så dette skal tages i betragtning ved bestemmelse af nøjagtigheden af en ELISA.

en spike assay kan udføres for at bestemme nøjagtigheden af ELISA resultater. I dette assay tilsættes eller tilsættes en kendt mængde rekombinant protein til prøven. Derefter måles mængden af materiale ved hjælp af standardkurven. Store afvigelser i de målte værdier kan indikere fejl på grund af ukendte elementer i analysen.

linearitet assay

linearitet assay bruges også til at bestemme nøjagtigheden af ELISA. I dette tilfælde fortyndes den ‘spikede prøve’ serielt til 1:2, 1:4 og 1:8. Hvis koncentrationen af den ændrede prøve detekteres, og hvis resultaterne ikke viser en lineær ændring i målingerne, kan det indikere fejl i nøjagtigheden af ELISA.

i nogle tilfælde kan der observeres fejl ved visse koncentrationer og ikke længere observeres ved lavere koncentrationer. I sådanne tilfælde kan det være nødvendigt at fortynde prøven, før koncentrationsmålingerne udføres.

fejlfinding

baggrundsstøj kan skyldes en række faktorer, herunder:

• utilstrækkelig vask af brøndene
• forurenede vaskebuffere
• for meget detektionsreagens
• krydsreaktivitet af antistoffet
• udfældning af bufferen og/eller analyt

nogle gange kan der genereres dårlig standardkurve. Dette kan skyldes fejl i standardopløsning, nedbrydning af standard, standard er ukorrekt rekonstitueret, eller hvis kurven ikke passer til skalaen. I betragtning af sidstnævnte kan plotning udføres ved hjælp af forskellige skalaer, såsom log-log eller 5 parameter logistisk kurve.

Yderligere læsning

• alt indhold af immunosorbentassay (ELISA)
• Elisa-applikationer
• vestlig Blot – Lab-teknik anvendt til at detektere proteiner
• Antistofapplikationer
• måling af genekspression

skrevet af

Dr. Surat P

Dr. Surat dimitterede med en ph. d. i cellebiologi og Mekanobiologi fra Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, Indien) i 2016. Forud for sin ph. d. studerede Surat for en Bachelor of Science (B.Sc hun var modtager af en Indian Academy of Sciences sommer stipendium til at studere de proteiner, der er involveret i AIDs. Hun producerer kronikker om en bred vifte af emner, såsom medicinsk etik, data manipulation, pseudovidenskab og overtro, uddannelse, og menneskelig udvikling. Hun brænder for videnskabskommunikation og skriver artikler, der dækker alle områder inden for biovidenskab.

citater