forholdet mellem tidsperiode efter vasektomi og reproduktionskapaciteten af sæd opnået ved epididymal aspiration

abstrakt

baggrund: det er ikke veldefineret, om den forløbne tid efter vasektomi har nogen indflydelse på resultatet af IVF–ICSI ved hjælp af epididymal sæd. Vi analyserede retrospektivt resultaterne af 151 ICSI-cyklusser, hvor sæd fra vasektomiserede mænd blev brugt i forskellige tidsperioder efter vasektomi. Metoder: oocytter blev opnået efter en desensibiliserende ovariestimuleringsprotokol ved anvendelse af GnRH-agonist i forbindelse med rekombinant FSH og HCG. Sæd blev hentet ved perkutan epididymal sædaspiration. Cyklusserne blev opdelt i tre grupper: Karr 10 år efter vasektomi (gruppe 1, n = 47), 11-19 år efter vasektomi (gruppe 2, n = 79) og Karr 20 år efter vasektomi (gruppe 3, n = 25). RESULTAT: Som forventet var gennemsnitsalderen for mænd forskellig i de tre grupper (gruppe 3 > gruppe 2 > gruppe 1), og gennemsnitsalderen for kvinderne var også signifikant højere i gruppe 3 end i gruppe 1 og 2, skønt der ikke blev beskrevet nogen forskelle mellem gruppe 2 og 3. Alle andre laboratorie-og kliniske parametre var ens i de tre grupper. Den igangværende graviditet og implantation (henholdsvis 34, 25, 8% og 22, 15, 6%) faldt signifikant fra gruppe 1 til gruppe 3. KONKLUSION: Graviditet og implantationshastigheder efter ICSI med sæd fra vasektomiserede mænd er negativt korreleret med tidsintervallet fra vasektomi, hvilket ikke kan forklares udelukkende ved mandlig eller kvindelig aldring.

introduktion

ICSI er en vellykket assisteret reproduktionsbehandlingsteknik, der oprindeligt blev udviklet til at lindre mandlig faktor infertilitet (Palermo et al., 1992; Van Steirteghem et al., 1993). Resultaterne opnået med ejakuleret sæd synes ikke at være relateret til sædkoncentration eller morfologi (Nagy et al., 1995a; Svalander et al., 1996). Prognosen er kun kompromitteret i de tilfælde, hvor der ikke findes bevægelige sædceller (Nagy et al., 1995a).

Epididymal og testikulær sædaspiration anvendes rutinemæssigt til at opnå sædceller i tilfælde af obstruktiv og ikke-obstruktiv asoospermi. Befrugtningshastighederne svarer i disse tilfælde til dem, der opnås med sæd fra ejakulatet (Nagy et al., 1995b; Van Steirteghem et al., 1998). ICSI er derfor blevet et effektivt alternativ til at genoprette fertiliteten i tilfælde efter vasektomi, hvor en reanastomose er mislykket, eller tidsrummet fra vasektomi har resulteret i sekundære steder med epididymal obstruktion. Desuden kan ICSI eliminere de negative virkninger på fertiliteten af anti-sædantistoffer, der ofte findes hos disse mænd (Heidenreich et al., 1994). I de fleste obstruktive tilfælde, herunder Post-vasektomiserede mænd, er epididymal sædaspiration den valgte metode til at opnå sæd (Craft et al., 1995). Fin nål aspiration, som en teknik, er en enklere og mindre invasiv procedure end mikrokirurgisk indgreb på epididymiderne eller på testiklerne (Tournaye et al., 1998).

nylige rapporter tyder på, at mandlig fertilitet falder med alderen (Aurouks, 1993). Det er dog tidligere blevet offentliggjort, at sædkvaliteten i sig selv hos normale raske mænd ikke falder markant med tiden (Fisch et al., 1996). Desuden synes ICSI-resultatet ikke at være relateret til faderlig alder (Spandorfer et al., 1998).

på den anden side er tidsrelaterede negative virkninger på sædkvalitet og fertilitet blevet beskrevet hos Post-vasektomiserede hanner (Urry et al., 1990). Der er rapporteret om en højere forekomst af anti-sædantistoffer og sædklumpning sammen med et fald i andelen af motile sædceller (Veske, 2001).

på grund af de ovennævnte fordele ved ICSI i forhold til reanastomose er en betydelig andel af obstruktive asoospermiske patienter, der søger behandling af ICSI, vasektomiserede mænd. Fordi det ikke vides på nuværende tidspunkt, om perioden efter vasektomi har nogen indflydelse på resultatet af ICSI-IVF, vi analyserede forholdet mellem tidsperioden efter vasektomi og sædets reproduktionskapacitet efter ICSI.

materialer og metoder

vi analyserede retrospektivt resultaterne af 151 ICSI-cyklusser, udført på grund af post-vasektomi obstruktiv asoospermi, afsluttet i perioden fra juni 1998 til juni 2000. Patienterne blev tildelt tre grupper i henhold til tidsperioden efter vasektomi. Intervallet fra vasektomi blev afrundet til det nærmeste afsluttede år fra datoen for vasektomi til tidspunktet for ICSI. Alle tilfælde blev henvist til vores center, fordi de valgte ICSI frem for reanastomose af vas som den primære form for terapi. Alle tilfælde gennemgik perkutan epididymal sædaspiration (PESA) som teknikken til at opnå sæd. Gruppe 1 bestod af 47 cyklusser, hvor tidsperioden fra vasektomi var lurer 10 flere år; gruppe 2 involverede 79 cyklusser, hvor tidsperioden fra vasektomi var mellem 11 og 19 år, og gruppe 3 omfattede 25 cyklusser, hvor tidsperioden fra vasektomi var 20 år.

Ovariestimulering blev udført ved hjælp af en kombination af en GnRH-agonist (leuprolidacetat, Lupron Lars; Abbott Laborat Larrios do Brasil Ltda, s Larso Paulo, Brasilien), long protocol og rekombinant FSH (Gonal-F Lars; Serono Laboratorios, s Larso Paulo, Brasilien). Follikeludviklingen blev overvåget med periodiske målinger af serumøstradiol og vaginal ultralyd. HCG 10 000 IE(Profasi; Serono Laboratorios) blev administreret, når mindst to follikler nåede en gennemsnitlig diameter på 18 mm, og oocytgenvinding blev udført ved ultralydstyret transvaginal aspiration 34 timer senere.

Epididymal sæd aspiration

sæd blev hentet af PESA. En 27,5 gauge nål blev introduceret i den proksimale del af epididymis (normalt placeret i testikelens øverste pol), og en delikat sugning blev udført med en 1 ml sprøjte (B-D; Becton Dickinson Ind. Curitiba, Brasilien). Aspiratet blev anbragt i en petriskål og blev skyllet med IVF-50 medium (IVF Science Scandinavian, Gøteborg, Sverige). Prøven blev vurderet for tilstedeværelsen af bevægelig sæd. Hvis der i prøven ikke var nogen bevægelig sæd til stede, blev den epididymale aspiration gentaget.

Embryologilaboratorieprocedurer

oocytter opsamlet i ren follikelvæske blev straks sendt til det tilstødende embryologilaboratorium, hvor de blev identificeret ved hjælp af et dissekeringsmikroskop ved forstørrelse af Karr 50. Efter at være blevet identificeret blev oocytter anbragt i en enkelt brøndkulturskål (3260; Costar, Cambridge, MA, USA) med 1,0 ml 80 IE/ml hyaluronidase (Hyase-1; IVF Science Scandinavian) i 30 s og efterfølgende blev vasket flere gange i IVF-50 medium. Hver oocyt blev anbragt separat inde i en dråbe på 30 liter IVF – 50 medium og dækket med letvægt mineralolie (Ovoil 150; IVF Science Scandinavian) og inkuberet i 2-4 timer ved 37 liter C i en atmosfære med 5% CO2. I slutningen af inkubationsperioden blev cumulus-og corona radiata-celler fjernet med en plastpipette med en diameter på 135 liter, forbundet med en cellestripper (Mid Atlantic Diagnostics Inc., Medford, NJ, USA).

nuklear modenhed og ooplasmisk kvalitet blev evalueret ved hjælp af et inverteret lysmikroskop (Nikon Diaphot Microscope Purpur; Nikon Corporation, Tokyo, Japan) ved forstørrelse af purpur 200 eller purpur 400. Metafase-II (MII) oocytter blev mikroinjiceret inden for en periode på 2-4 timer efter opsamling. Metafase i (MI) oocytter blev observeret til ekstrudering af det første polære legeme med 4 H intervaller op til 8 h efter hentning, og injektionen blev udført i overensstemmelse hermed. Metoderne til sædinjektion er tidligere rapporteret (Abdelmassih et al., 1996).

efter sædinjektion blev oocytter inkuberet i 1 ml IVF-50 medium, dækket med mineralolie, i 16-18 timer. oocytter blev observeret 16-18 timer efter ICSI for tilstedeværelse eller fravær af pronuclei og polære legemer (Nagy et al., 1998a). Befrugtning blev betragtet som normal, når to klart adskilte pronuclei var til stede. Hvis en enkelt pronucleus blev observeret, blev en anden evaluering udført ca. 4 timer senere. Når tilstedeværelsen af tre pronuclei blev detekteret, blev oocyten kasseret.

oocytter indeholdende to pronuclei blev dyrket separat i dråber på 30 liter IVF-50 medium dækket med mineralolie i en petriskål (3260; Costar) og blev opbevaret indtil overførsel. Embryonerne blev observeret ved 42 timer (dag 2) og ved 68 timer (dag 3) efter injektion og klassificeret efter de kriterier, der blev foreslået af Staessen (Staessen et al., 1989). I henhold til antallet af blastomerer og den relative andel af anukleatfragmenter, der er til stede i området pellucida, embryoner blev klassificeret til en af de fire kategorier: 1, Fremragende (type A), når der ikke var noget anukleatfragment (6 – til 8-celletrin på dag 3); 2, God (type B), når <20% af embryoet var fragmenteret (6 – til 8-celletrin på dag 3 eller <6 celler uden fragmentering); 3, fair (type C), når den relative mængde fragmenter var mellem 20 og 50%; og 4, dårlig (type D), når >50% af embryoet var fragmenteret. Embryoner med >50% fragmentering blev ikke overført.

på overførselstidspunktet blev embryoner indlæst i 15 liter IVF-50-medium ved hjælp af et kateter på 23 cm (Simcare Manufacturing Ltd, Hythe, Kent, UK).

Den lutealfase blev støttet af den daglige administration af 800 mg vaginal progesteron (Utrogestan®; Laboratoires Besins-Isvovesco, Paris, Frankrig) og transdermic 100 mg estradiol patches skiftes dagligt (Estraderm TTS100®; Biogalênica Laboratório, São Paulo, Brasilien). Serumkurs-HCG-niveauer blev målt 12 dage efter embryooverførslen.

Transvaginal ultralyd blev udført hos alle patienter med stigende urin-HCG-titere; tilstedeværelse og antal intrauterin svangerskabssække blev vurderet såvel som tilstedeværelsen af en føtalpol og hjerteaktivitet. Graviditet blev overvåget af patientens fødselslæge, og det endelige resultat blev rapporteret til klinikken både af fødselslægen og patienten.

statistisk analyse

envejsanalyse af varians (ANOVA) og Kruskal–Vægis-test blev brugt til at sammenligne midler til kvindelig og mandlig alder, befrugtningshastighed, embryokvalitet, antal overførte embryoner og tidsperiode efter vasektomi. Beredskabstabelanalyse og Fishers nøjagtige test blev brugt til at sammenligne graviditet, implantation og abortfrekvens.

resultater

de vigtigste resultater af de 151 cyklusser, der er inkluderet i undersøgelsen, er præsenteret i tabel I. Gennemsnitsalderen for mændene steg fra gruppe 1 til 3, og forskellen mellem hver gruppe var statistisk signifikant (P < 0,0001). Den gennemsnitlige kvindelige alder var signifikant lavere i gruppe 1 sammenlignet med gruppe 2 og 3, men ikke forskellig i gruppe 2 sammenlignet med gruppe 3 (tabel i).

det gennemsnitlige antal oocytter, der blev hentet og injiceret, og befrugtningshastighederne var ens i alle tre grupper. Kvaliteten af embryonerne og antallet af overførte embryoner var også ens i de tre grupper (tabel i).

den kliniske graviditetsrate og den igangværende graviditetsrate korrelerede signifikant med tidsperioden for vasektomi (P < 0,05; kr2-test for trend), og den længere periode med vasektomi var forbundet med færre graviditeter (tabel i). Implantationshastigheden faldt også fra gruppe 1 til 3, og forskellen mellem alle grupper var statistisk signifikant (P < 0,05, beredskabstabelanalyser og Fishers nøjagtige test). Abortfrekvensen viste en tendens til at stige fra gruppe 1 til 3, men den nåede ikke statistisk signifikans blandt grupperne.

for at udelukke effekten af kvindelig alder på resultaterne analyserede vi dataene fra 84 af de 151 cyklusser, hvor kun de kvinder, der var 35 år gamle, var inkluderet. Resultaterne, der er organiseret på samme måde i tre grupper, er vist i tabel II. forskellen i den gennemsnitlige mandlige alder for de tre grupper forblev signifikant (P < 0,0001), men kvindelig alder adskiller sig ikke signifikant blandt de tre grupper. Antallet af injicerede og befrugtede oocytter var også ens i de tre grupper samt antallet og kvaliteten af embryoner overført til patienterne. Den igangværende graviditet og implantation var signifikant højere i gruppe 1 og 2 sammenlignet med gruppe 3 (tabel II).

Diskussion

vores data bekræfter, at perkutan epididymal sædaspiration kombineret med ICSI er en vellykket behandlingsmulighed til lindring af infertilitet efter vasektomi. Teknikken til sædudtagning er enkel, udført med lokalbedøvelse og kan gentages uden åbenbar skade på epididymis.

det er vigtigt, at resultaterne af vores undersøgelse for første gang antyder en negativ sammenhæng mellem graviditetsresultatet af assisteret befrugtning og tidsrummet fra vasektomi til behandling. Forskellen i graviditet og implantationshastigheder fortsatte, efter at resultaterne blev korrigeret for kvindernes alder. De eneste tydelige kliniske forskelle, der var tilbage, var gennemsnitsalderen for mændene mellem grupperne og tidsperioden for vasektomi. Indflydelsen af mandlig alder på resultaterne af assisteret reproduktion er ikke godt bestemt. Nogle undersøgelser tyder på et fald i fertilitetspotentialet med fremskreden mandlig alder (1993), men de fleste undersøgelser konstaterede ikke en sammenhæng mellem aldring og reproduktionspotentiale hos mænd (Krause og Habermann, 2000). Også individuel opfølgning i op til 25 år afslørede ingen vigtige ændringer (Fisch et al., 1996). Endnu vigtigere med hensyn til vores undersøgelse påvirkes ICSI-resultater for forskellige diagnostiske kategorier ikke af den mandlige partners alder (Spandorfer et al., 1998) i modsætning til den vigtige rolle i den kvindelige partners alder (Abdelmassih et al., 1996; Devroey et al., 1996).

succesraten for vasektomi-reversering ved gendannelse af fertilitet er et omvendt forhold til tidsrummet fra vasektomi (Belker et al., 1991). Indtil nu blev de tidsrelaterede negative virkninger af vasektomi i forhold til fertilitet tildelt mekaniske faktorer (den stigende forekomst af sekundære steder med epididymal obstruktion), hvilket gjorde anatomisk restaurering vanskeligere og til udseendet af signifikante titere af anti-sædantistoffer (Heidenreich et al., 1996). ICSI overvinder naturligvis den mekaniske blokering, og resultaterne opnået med teknikken er uafhængige af immunologiske faktorer (Nagy et al., 1995c).

alle tilfælde inkluderet i vores undersøgelse gennemgik epididymal sædaspiration. Silber et al. har antydet, at i tilfælde af kronisk blokeret epididymis lider sædceller ændringer relateret til aldring med et signifikant fald i motilitet mod den distale del (Silber et al., 1995). På den anden side har Moore rapporteret, at der i disse tilfælde også findes et uforholdsmæssigt stort antal døde eller døende sædceller i den proksimale del (Moore, 1998). Forfatteren antyder, at epididymal væske under normale forhold beskytter levedygtig sæd fra akrosomale ensymer frigivet af sæd i degenerationsprocessen. Stagnationen sekundær til kronisk obstruktion ville forstyrre denne beskyttelsesmekanisme. Desuden er det blevet påvist, at testikulær sæd-DNA hos mænd med obstruktiv asoospermi er signifikant mindre beskadiget end proksimal epididymal sæd-DNA (Steele et al., 1999). I samme undersøgelse fandt forfatterne, at DNA-kvalitet i sæd opnået fra testiklen er den samme som den, der findes hos normale mænd, hvilket tyder på, at skaden, der findes i epididymal sæd, erhverves med tiden efter at være produceret. Det er fristende at spekulere i, at epididymal sæd-DNA-skade øges med tiden for obstruktion og i de tilfælde, der præsenteres her, tid fra vasektomi. I samme tankegang var brugen af immotil (på grund af nekrosoospermi) ejakuleret eller epididymal sæd til ICSI forbundet med meget dårlig befrugtning og embryonal udvikling; imidlertid, testikulær sæd (fra den samme patient), selvom immotil, gav et meget forbedret resultat af behandlingscyklussen (Nagy et al., 1995a; Tournaye et al., 1996; Nagy et al., 1998b).

i denne undersøgelse blev der ikke observeret nogen signifikante forskelle i befrugtningshastigheden og i kvaliteten af embryoner overført ved 72 timer efter befrugtning blandt de tre grupper. Virkningerne af at bruge molekylært beskadiget sæd på befrugtning kunne maskeres ved brug af ICSI, og tidlige stadier af embryonudvikling afhænger hovedsageligt af moderinformation, da det embryonale genom aktiveres efter 8-celletrinnet (Braude et al., 1988). Imidlertid kan øget DNA-beskadigelse af epididymal sæd (udelukkende anvendt i de rapporterede tilfælde) udgøre en forklaring på de lavere embryoimplantationshastigheder og for højere abortfrekvenser, der findes i tilfælde med en længere periode fra vasektomi.

vores resultater adskiller sig fra de data, der rapporteres af andre (Sukcharoen et al., 2000), men kan ikke være i direkte modsigelse. Antallet af tilfælde inkluderet i vores undersøgelse var signifikant større, og de tidligere rapporterede data omfattede nogle tilfælde, hvor ICSI blev udført med sæd opnået fra testiklerne.

resultaterne rapporteret her kan have vigtige kliniske implikationer. Perkutan epididymal sæd aspiration er en enkel, hurtig og populær procedure for at opnå sæd fra mænd med obstruktiv asoospermi; i lyset af denne undersøgelse kan finnålsaspiration fra testiklerne imidlertid repræsentere en bedre tilgang, især i de tilfælde med langvarig obstruktionstid. Der bør dog foretages yderligere indsamling og analyser af data fra prospektive undersøgelser for at fastslå den bedste intervention i disse tilfælde.