interstitiel Deletion på 5k22, 2k23.1 inklusive APC og TSSK1B hos en Patient med adenomatøs polypose og Asthenoteratosospermi

abstrakt

interstitiel 5k22-sletninger er relativt sjældne og repræsenteres normalt af alvorlige kliniske træk såsom udviklingsforsinkelse og væksthæmning. Her rapporterer vi en 23-årig mandlig patient, der henvises til vores laboratorium for genetisk bekræftelse af mulig familiær adenomatøs polypose. MLPA og det efterfølgende array CGH identificerede en ca. 8 Mb-størrelse sletning i 5k22.2k23.1 locus. Yderligere analyse af det slettede område og generne inden for antydede en mulig rolle for TSSK1B (testis-specifik serin/threoninkinase 1) gen i patientens reproduktionskapacitet. Sædanalyse bekræftede, at patientens reproduktionsevne var nedsat, og at han led af asthenoteratosospermi. Analyse af asoospermifaktorregionen på Y-kromosomet afslørede ingen mikrodeletioner. Yderligere sekventeringstest kunne ikke finde en alternativ forklaring på patientens infertilitet. Denne sag viser en mulig rolle TSSK1B i mandlig reproduktion.

Karger AG, Basel

etablerede fakta

• interstitielle 5k22-sletninger er sjældne og ledsages typisk af neurologiske og udviklingsmæssige komplikationer.

• de fleste gener i det kromosomale bånd 5k22 er ikke blevet grundigt undersøgt eller associeret med en klinisk fænotype.

Novel Insights

• vi præsenterer en sag med en heterosygøs sletning i 5k22.2k23.1 locus, der ikke udviser de udviklingsmæssige problemer, der typisk opstår ved denne type sletning.

• TSSK1B-genet inden for dette locus er for nylig blevet funktionelt testet i modelorganismer; her kan vi se den første rapport om haploinsufficiens af dette gen, der potentielt forårsager en human fænotype.

• TSSK1B kan være en formodet årsag til mandlig faktor infertilitet.

interstitielle 5k22k23 sletninger er relativt sjældne og ledsages normalt af alvorlige kliniske træk såsom udviklingsforsinkelse, væksthæmning og dysmorfe træk . Sletninger i denne region involverer ofte APC-tumorundertrykkende gen (OMIM 611731) og fører til familiær adenomatøs polypose (FAP). FAP er en arvelig autosomal dominerende tilstand, der fører til flere tarmpolypper og disponering for tyktarmskræft. Selvom den første rapporterede interstitielle sletning af 5K var i 1979 , blev APC-locus opdaget senere af Kintler et al. , der kortlagde det til 5k22.2 bånd. På grund af tidspunktet for denne opdagelse undersøgte alle kliniske tilfælde af 5K-sletninger indtil det øjeblik ikke manifestationen af FAP hos patienten og bidrager derfor ikke med nogen information om forbindelsen mellem 5k22-sletninger og FAP. Patienter med kromosomale sletninger, der inkluderer APC, diagnosticeres oftest, når deres dysmorfe træk afsløres i spædbarnet, eller når de ikke trives og viser andre tegn på forsinket udvikling ; de, der forbliver asymptomatiske, oplever normalt gastrointestinale manifestationer såsom vægttab, rektorhaggia og tarmobstruktion.

på grund af den grundige karakterisering af det molekylære grundlag for FAP og sværhedsgraden af dets patologiske symptomer koncentreres klinisk fokus oftest på selve APC-genet eller fysiske konsekvenser af en stor kromosomal deletion, hvilket afslører lidt eller ingen information om funktionen af andre gener i 5k22.2-båndet. Selvom et antal kromosomale afvigelser er blevet beskrevet , har analyse af konsekvenserne en tendens til at fokusere på de resulterende dysmorfe træk eller FAP uden at give funktion til enkeltgener. Store sletninger i selve kromosomet er til stede med en kompleks fænotype, der kombinerer flere kliniske træk fra de ovennævnte og kan være en udfordring for den diagnostiske kliniker.

sagsrapport og metoder

patienten er en 23-årig bulgarsk mand uden forudgående klinisk historie. Ved sin første optagelse klagede han over hyppig rektorhaggia uden abnormiteter i afføringsfrekvens eller tab af appetit. En sigmoidoskopi blev udført med resultater, der pegede mod FAP, som han blev rettet til en specialiseret Gastroenterologisk afdeling for yderligere test. Familiehistorie var utilgængelig på grund af etiske grunde, da patienten havde været i en plejefamilie siden en tidlig alder, og der var ingen kontakt med hans biologiske forældre. Fibrocolonoscopy afslørede et stort antal polypper i endetarmen og sigmoid – bleg til mørk rød – med hyperplasi (Fig. 1A). Der var ingen FAP-associerede læsioner uden for mave-tarmkanalen. På dette tidspunkt blev patienten henvist til vores genetiske laboratorium for at bekræfte FAP-diagnosen.

genomisk DNA blev isoleret fra perifert blod ved hjælp af standardprotokoller og blev brugt til at screene APC-genet for større sletninger og duplikationer ved hjælp af mlpa. MLPA APC kit blev opnået fra MRC-Holland (PO43, Amsterdam, Holland), og analysen blev udført i henhold til producentens anvisninger.

for at bestemme grænserne for sletningen blev genomisk DNA analyseret ved array CGH på et højopløseligt 1m oligonukleotid array ifølge producentens protokol (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Copy number variation (CNV) detektion blev udført ved hjælp af CytoGenomics (version 2.9.2.4, Agilent Technologies). Følgende analyseindstillinger blev brugt: aberrationsalgoritme ADM-2, tærskel: 6.0, vindue størrelse: 0.5 Mb, filter: 5 sonder, og log2 ratio = 0.29.

ejakulat blev løsrevet i laboratoriet og undersøgt i rækkefølgen: observation af nativt præparat, bestemmelse af sædkoncentration, vurdering af vatpinde for vitalitet i mobilitet <40% og evaluering af sædmorfologi i henhold til kriterierne for ESHRE/NAFA ved hjælp af Sædklasseanalysator (SCA), et system med kvantitativ og kvalitativ analyse af parametre for human sæd.

molekylær test for mikrodeletioner i acsoospermifaktorregionen blev udført som beskrevet i retningslinjerne og standarderne for European Academy of Andrology .

Sanger-sekventering blev udført for at undersøge tidligere rapporterede regioner forbundet med mandlig infertilitet, dvs.TSSL (OMIM 601486), SEPT12 (omim 611562), SLC26A8 (omim 608480), SYCE1 (omim 611486) og derefter TSSK1B (omim 610709).

resultater

vi fandt et fald i spidsarealet på 50% i alle APC-specifikke genprober ved mlpa. Da dette svarede til en heterosygøs sletning af hele APC-gensekvensen, var vores næste trin at udføre et array CGH for at bestemme grænserne for sletningen. De opnåede resultater viste, at den interstitielle deletion i kromosom 5K var begrænset til regionen 5k22, 2k23, 1, cirka 8 Mb lang (Fig. 2A). Sletningen spænder over regionen mellem basepar chr5: 111.779.298-119.794.955 (GRCh37/hg19), karyotype: arr 5k22.2k23.1(111779298_119794955), hvilket bekræfter APC-sletningen og involverer 29 andre proteinkodende gener i sletningen. Sammen med de velbeskrevne APC-og MCC-gener var et andet gen, TSSK1B, tidligere blevet undersøgt og tilskrevet en specifik funktion. TSSK1B udtrykkes stærkt i testis og kræves under spermatidudvikling . Derfor besluttede vi at udføre en sædanalyse og teste vores patient for infertilitet, sædtal, morfologi og motilitet.

den endelige evaluering konkluderede, at patienten led af asthenoteratosospermi med en prævalens af cephaliske defekter, 97% atypisk sædmorfologi og reduceret sædmotilitet (Fig. 2C). Teratosospermi-indeksværdien ved 1,71 viser mere end 1 defekt pr. Da denne fænotype oftest er forårsaget af mikrodeletioner i asoospermifaktorregionen og store kromosomale sletninger inden for Y-kromosomet ikke blev vist på arrayet CGH, udførte vi molekylær test for mulige mikrodeletioner i Y-kromosomet. Vores analyse afslørede ikke nogen sletninger inden for asoospermifaktormarkørerne sY84, sY86, sY127, sY134, sY254 og sY255. Test for de mest almindelige mutationer i gener forbundet med mandlig infertilitet, såsom DASL, SEPT12, SLC26A8 og SYCE1 afslørede ingen ændringer. Endelig afslørede sekventering af TSSK1B-genet ingen abnormiteter inden for den eneste nuværende kopi.

disse resultater indsnævrede muligheden for, at TSSK1B er et stærkt kandidatgen for mandlig infertilitet og er involveret i vores patients asthenoteratosospermi-fænotype.

Diskussion

kromosomale sletninger af 5k22-båndet, der resulterer i FAP, er sjældent rapporteret i hele litteraturen. Eksisterende rapporter har til formål at sammenligne og kontrastere sletninger mellem forskellige patientsager; imidlertid, de patologiske implikationer af disse sletninger er ikke undersøgt detaljeret ud over den indledende kliniske diagnose . Størrelsen på det interstitielle slettede område på 5 K varierer meget blandt patienter, der spænder fra 1,7 Mbp til 20 Mbp og større, hvor størstedelen af tilfældene præsenterer forskellige grader af indlæringsvanskeligheder, manglende trivsel og mindre til større dysmorfe tegn . Disse symptomer er ikke begrænset til et enkelt kromosomalt bånd (Fig. 2B), som har forhindret klassificering af undertyper af 5K-sletning, skønt der er gjort flere forsøg . Bemærkelsesværdige fund fra disse undersøgelser viser mangel på en genotype-fænotype-korrelation i tilfælde, der deler en berørt region, samt ingen sammenhæng mellem størrelsen på deletionen og sværhedsgraden af fænotypen.

så vidt vi ved, blev den sidste gennemgang af gener og deres funktioner inden for denne region udført af Ofner et al. . Indtil videre har kun 4 gener (APC, MCC, TRIM36 og HSD17B4) placeret inden for det slettede område hos vores patient været forbundet med en sygdom i OMIM, selvom forskning pågår. Desuden blev fertilitetsstatus for de fleste patienter med en 5K-sletning aldrig offentliggjort på grund af deres tidlige alder, og deres tilstand blev aldrig fulgt forbi den første diagnose. I tidligere offentliggjorte rapporter om 5K-sletninger har kun en enkelt sag dokumenteret en mulig arv af en TSSK1B-sletning fra en mistænkt mandlig bærer; patientens far kunne dog ikke testes for at bekræfte, at sletningen blev arvet. Med hensyn til TSSK1B, der omfatter CNV ‘ er i den normale befolkning, er der kun en enkelt DGV-post af et kopitab (nsv599396, samlet stikprøvestørrelse 17.421; PMID 21841781) .

i den patient, der præsenteres her, observerede vi ikke alvorlige patologiske symptomer, der udstilles i typiske 5k22-sletningstilfælde udover FAP. Dette kan forklares ved muligheden for, at den sletning, vi præsenterer, ikke overlapper fuldstændigt med sletninger hos patienter med svære dysmorfe/udviklingsmæssige problemer (Fig. 2B). Mens den almindelige kliniske fænotype for patienter med sletninger i den lange arm af kromosom 5 dækker en bred vifte af funktioner såsom udviklingsforsinkelse, manglende trivsel, psykomotorisk retardering, flad næsebro, og andre , den fænotype, der præsenteres af vores patient, er næsten udelukkende repræsenteret ved den heterosygøse deletion af APC-genet og den deraf følgende FAP-diagnose.

den genetiske baggrund for testikulære infertilitetsfaktorer, specifikt asthenosospermi, har længe været begrænset og dårligt beskrevet. Størstedelen af testikulære infertilitetsfaktorer og deres genetiske baggrund er blevet knyttet til gener, der er bosiddende i Y-kromosomet og kromosomafvigelser, der involverer Y-kromosomet . Der har været fremskridt på området, da nyere forskning har til formål at relatere sæddysmorfologiske fænotyper til specifikke gener, såsom DASL, SYCE1, SLC26A8, SEPT12 og andre, der har en funktion relateret til spermatogenese . Alligevel er området for mandlig infertilitetsgenetik stadig relativt nyt, og nye bidrag er afgørende for den løbende forbedring af genetisk testning, diagnose og rådgivning .

Testis-specifik serin/threoninkinase 1 er et intronløst gen, en del af TSSK-familien og en gren af superfamilien serin/threoninkinase. Det blev først identificeret af Bielke et al. , der i deres undersøgelse tilskrev genet en åben læseramme på 1092 bp, der koder for et 364-aa-protein. Human TSSK1B blev undersøgt ved hjælp af nordlige og dot blots, som viste 85% lighed med murine Tssk1b.genet blev kortlagt på kromosom 5k22, i en region, der ikke viser synteny til musens kromosomale locus af Tssk1b . Yderligere undersøgelser har påpeget, at den specifikke ekspression af Tssk1b er lokaliseret næsten udelukkende i testiklerne, hvilket implicerede en funktion relateret til reproduktion og spermatogenese . Temporale ekspressionsundersøgelser viste yderligere, at Tssk1b udelukkende udtrykkes i de sene stadier af sædmodning . Funktionen af Tssk1b blev bekræftet in vivo af Hsu et al. brug af kimære mus til at bestemme, om en målrettet sletning i Tssk1b og Tssk2 kan overføres i kimlinjen. Deres eksperimenter viste, at de kimære mus kun producerede afkom af vildtype, selvom sædceller indeholdt både vildtypen og den muterede allel. Yderligere undersøgelse af testis og epididymis i kimæren viste, at kun et lavt antal sædceller kunne nå modning . I deres undersøgelse, et al. foreslog, at infertilitet er forårsaget af haploinsufficiens. Selvom den nøjagtige mekanisme for den patologiske manifestation ikke er undersøgt, synes de funktionelle implikationer af en allel-deletion i dette gen at resultere i ændret sædmorfologi. Hos mennesker kan en mikrodeletion, der omfatter TSSK1B, således udgøre en risikofaktor for mandlig infertilitet.

indtil videre er TSSK1B udelukkende undersøgt i dyremodeller, og de funktionelle implikationer er ikke undersøgt hos mennesker. Her præsenterer vi, hvad vi betragter som det første tilfælde af sammenhæng mellem en slettet kopi af TSSK1B og asthenosospermi, hvilket muligvis bekræfter forbindelsen mellem gen og funktion in vivo.

konklusion

dette er et af de få tilfælde, der beskriver en ung voksen med en stor interstitiel deletion i kromosom 5, med symptomer, der manifesterer sig i en alder, hvor patienten kan testes for fertilitet. Så vidt vi ved, er ingen patienter med sletninger i 5k22.2-båndet blevet undersøgt for infertilitet, og kun et tilfælde af en mulig, men alligevel ubekræftet arv af en TSSK1B-sletning fra en mandlig bærer er blevet observeret. Selv de mildeste udviklingsændringer, der observeres ud over FAP-fænotypen, bør føre til yderligere undersøgelse af denne kromosomale region ud over APC-genet ved hjælp af de ovenfor anførte metoder til at definere eventuelle kromosomale ændringer. Vi vil også gerne tilskynde til yderligere undersøgelse af TSSK1B ‘ s rolle i mandlig reproduktion og dens rolle i at forårsage asthenosospermi.

derudover demonstrerer vi nytten af både MLPA og array CGH i klinisk praksis. MLPA kan betragtes som førstelinjeanalyse, og hvis der findes en sletning af hele målgenet, kunne resultaterne bekræftes, og breakpoints lokaliseres ved array CGH.

anerkendelse

vi er taknemmelige for familien, der leverede de kliniske oplysninger og gav tilladelse til at offentliggøre den.

Erklæring om etik

patienten underskrev informerede samtykkeformularer til genetisk testning og medicinsk fotografering. Forfatterne har ingen etiske konflikter at afsløre.

oplysningserklæring

forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

forfatter kontakter

artikel / offentliggørelse detaljer

ophavsret / lægemiddeldosering / ansvarsfraskrivelse

ophavsret: Alle rettigheder forbeholdes. Ingen del af denne publikation må oversættes til andre sprog, gengives eller bruges i nogen form eller på nogen måde, elektronisk eller mekanisk, inklusive fotokopiering, optagelse, mikrokopiering, eller ved ethvert informationslagrings-og hentningssystem, uden skriftlig tilladelse fra udgiveren.
lægemiddeldosering: forfatterne og udgiveren har gjort alt for at sikre, at lægemiddeludvælgelse og dosering, der er beskrevet i denne tekst, er i overensstemmelse med de nuværende anbefalinger og praksis på offentliggørelsestidspunktet. Imidlertid, i betragtning af igangværende forskning, ændringer i regeringens regler, og den konstante strøm af information vedrørende lægemiddelterapi og lægemiddelreaktioner, læseren opfordres til at kontrollere indlægssedlen for hvert lægemiddel for ændringer i indikationer og dosering og for tilføjede advarsler og forholdsregler. Dette er især vigtigt, når det anbefalede middel er et nyt og/eller sjældent anvendt lægemiddel.
ansvarsfraskrivelse: erklæringerne, udtalelserne og dataene i denne publikation er udelukkende de enkelte forfattere og bidragydere og ikke af udgiverne og redaktøren(e). Udseendet af reklamer eller/og produktreferencer i publikationen er ikke en garanti, godkendelse eller godkendelse af de annoncerede produkter eller tjenester eller af deres effektivitet, kvalitet eller sikkerhed. Udgiveren og redaktøren(e) fraskriver sig ansvaret for enhver skade på personer eller ejendom som følge af ideer, metoder, instruktioner eller produkter, der henvises til i indholdet eller reklamerne.